[发明专利]用于在环境温度下进行低密度脂蛋白胆固醇的直接测试条测量的试剂组合及方法

说明书

本申请是2005年2月3日提交的题为“用于在环境温度下进行低密度脂蛋白胆固醇的直接测试条测量的试剂组合及方法”的中国专利申请200580010409.0的分案申请。

发明背景

本发明主要涉及使用干燥的测试条(test strip)对血浆、血清或全血样品进行体外分析，更具体地，对样品中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行测定。

血液中的胆固醇水平已被接受作为冠心病风险的一个重要指示物。胆固醇存在于血液的脂蛋白中，并通过其进行转运。“总胆固醇”包括低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、中密度脂蛋白胆固醇(IDL-C)、乳糜微粒胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。从流行病学和临床研究中已知，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，以及在较低程度上Lp(a)-C，与冠心病之间呈正相关。传统意义上，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)一直被视为“坏”胆固醇。另一方面，临床研究发现高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(“好”胆固醇)水平和冠心病之间呈负相关。单独来说，血液中的总胆固醇水平，即高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、中密度脂蛋白胆固醇(IDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)和乳糜微粒胆固醇的总和，通常不被视为足够证明冠心病风险的指示物，因为总胆固醇的整体水平不能揭示这些不同来源胆固醇的相对比例。为更好地评估心脏疾病的风险，最好是除测定血样中的总胆固醇水平外，也对血样中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量进行测定。

临床实验室测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量最常用的方法是Friedewald计算法。它通过测定总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和甘油三酯的含量来估计低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。尽管Friedewald计算法很方便，但其存在一些明确的缺点。Nauck et al.Methods for Measurement of LDL-Cholesterol:A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus CalculationClin.Chem.48.2(2002)。例如，由于Firedewald计算法涉及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以外的物质的测定，会受到由于测定公式中其他脂类的潜在复合不准确性的影响。而且，它的应用只限于甘油三酯水平低于400mg/dL的生物学液体，据报道当甘油三酯水平超过200mg/dL后，其准确性下降。

超速离心法是一项已知的分离和量化血清或血浆样品中各种脂蛋白成分的技术。但是，超速离心法冗长、耗时，并且超速离心过程中的高盐浓度和离心力会明显改变高度不稳定的脂蛋白。“另外，由于使用了多种不同类型的设备和试管，使得一个实验室与另一实验室的重复非常困难，而且持续分离需高度依赖于技术员的技能和细致。”(Id.At 238)。

另一项测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的技术是电泳法。这种技术也存在某些缺点。电泳凝胶测定不易自动操作，而且其准确性和可重复性也至少部分依赖于进行测试的技术人员的技术。

其他涉及非低密度脂蛋白的沉淀、加热和其它步骤，被称为匀相测定的方法近来也已投入使用。美国专利5,888,827(Kayahara,Sugiuchi,et al.；转让给Kyowa Medex Co.,Japan)中公开了一种测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的匀相测定法。’827专利描述了一种量化液体样品中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的两段液相反应。在第一步中，将含有低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的样品放入第一种试剂中，该试剂含有三甲基β环糊精(作为糖化合物)、聚氧乙烯单油酸酯(作为蛋白增溶剂)、EMSE(N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(N-ethyl-N-(3-methylphenyl)-N’,succinylethylenediamene))和Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)。然后将反应混合物加热至37℃，5分钟后读取吸收率。加入第二种试剂，其中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨酰安替比林和Tris缓冲液，过5分钟后再次测量同波长下的吸收率。分别将标准胆固醇溶液按同样步骤进行操作，比较各自的吸收率值，来计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。在许多应用中，本方法中操作，如加热、多种试剂和多重读数被视为缺点。由于这种方法即使是在实验室中进行也很复杂、冗长，因而不适用于现场医护(POC)环境。