[发明专利]一种检测葡萄A病毒的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄A病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物。

背景技术

葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)为线形病毒科(Flexiviridae)葡萄病毒属(Vitivirus)病毒，是葡萄皱木复合病(rugose wood complex disease)的重要病原之一，可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等症状。葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)分布范围很广，目前在世界多个国家和地区均有发生，自然寄主为葡萄，可导致被侵染的葡萄植株出现卷叶，叶缘和叶柄变红，茎的局部隆起和碎裂等症状，可以通过机械接种、嫁接和无性繁殖材料传播。自然条件下由粉蚧以半持久方式传播，也可以由介壳虫(Neopulvinaria innumerabilis)传播。葡萄生产周期长且长期无性繁殖，带毒种苗常造成病毒病广泛流行，严重影响葡萄产量和品质。栽培无病毒苗木是防治果树病毒病的有效途径之一，而病毒检测水平的高低直接影响无病毒苗的推广。为了有效提高检测效率，需要建立相应的检测技术。

目前葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)常采用的检测方法有两种，一种是血清学检测方法，如DAS-ELISA，但该方法不仅灵敏度较差，而且特异性也较低；另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是需要特殊的仪器，如PCR仪。而且上述两种方法的检测需要较长的时间，如血清学方法大约需要2天，分子生物学方法大约需要5小时，无法满足现场快速检疫的要求。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，通过逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)就可以完成RNA的检测。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。目前RT-LAMP技术已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌及寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决技术问题是如何检测葡萄A病毒(Grapevine virus A，GVA)。

本发明首先提供了一种成套引物，由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB组成，它们的核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。其中，序列表的序列1由20个核苷酸组成，序列表的序列2由19个核苷酸组成，序列表的序列3由39个核苷酸组成，序列表的序列4由39个核苷酸组成，序列表的序列5由19个核苷酸组成，序列表的序列6由20个核苷酸组成。所述成套引物可以对葡萄A病毒的总RNA进行特异性的逆转录环介导等温扩增。

所述成套引物中，所述引物F3、所述引物B3、所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF和所述引物LB的摩尔比可为1:1:8:8:4:4。

所述成套引物中，各引物的量如下：0.2μmol所述引物F3、0.2μmol所述引物B3、1.6μmol所述引物FIP、1.6μmol所述引物BIP、0.8μmol所述引物LF、0.8μmol所述引物LB。。

所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。

所述成套引物中各条引物可分别单独包装。所述成套引物中各条引物可按照所述摩尔比混合在一起。所述成套引物中各条引物可按照所述量混合在一起。