[发明专利]酯酶est4、酯酶EST4、重组质粒和基因工程菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及酯酶基因、酯酶、重组质粒、基因工程菌株及其应用。

背景技术

分子微生物生态学的研究已证明环境中存在大量的未能培养的微生物。某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1％，这提示我们超过99％的微生物尚未能培养，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。近年来随着宏基因组学技术迅速发展，不仅排除了传统微生物培养方式的缺点，而且可以直接从环境样品中提取DNA，通过功能筛选和基因组文库的构建获得新的功能基因，从而提高了获得新生物活性物质的机会，有可能得到具有应用价值的新基因。

酯酶和脂肪酶都是羧酸水解酶，被分为8个族。酯酶(Esterases)能够水解少于10个碳原子的短链脂肪酸的酯键，而脂肪酶(Lipases)则能够水解多于10个碳原子的长链脂肪酸的酯键。脂肪酶和酯酶是重要的工业化酶制剂品种，可以催化水解、转酯、酯合等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中，用于有机合成的具有酯化或转酯化功能的酯酶和脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细品化学品和手性化合物有重要意义。

外消旋的动力学拆分是迄今为止脂肪酶最为常见的反应。仲醇的酶促拆分是迄今为止脂肪酶催化拆分最常用的底物。这不仅是因为仲醇在手性合成中的重要性，同时更重要的是，一般情况下脂肪酶对仲醇特别是芳香仲醇具有非常好的手性识别，具有较好的拆分效果。手性芳香仲醇是医药、化妆品、农用化学品等领域不可缺少的中间体。

在食品、化妆品、酿酒和医药行业应用最广泛的香料物质为萜烯醇的脂肪酸酯，如香茅醇、香叶醇、芳樟醇的脂肪酸酯等。利用天然原料萜烯醇大规模的生产香料酯，原料萜烯醇成本较低，因此利用脂肪酶或酯酶作为催化剂，催化萜烯醇与酸或者酯发生反应制备香味成分萜烯酯具有重要的应用价值。同时根据美国、欧洲等国的法律规定：经过生物法合成的香料被视为天然香料，其产品附加值远大于化学法合成香料，因此生物方法合成香料具有潜在的应用价值。

目前，现有技术中还没有从深海污泥中提取酯酶DNA的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种来源于深海污泥的酯酶基因est4、由该酯酶基因est4编码的酯酶EST4以及该酯酶EST4的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种含有来源于深海污泥的酯酶基因est4的重组质粒和含有该重组质粒的基因工程菌株以及该基因工程菌株的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种来源于深海污泥的酯酶基因est4，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，上述的酯酶基因est4所编码的酯酶EST4的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种来源于深海污泥的酯酶EST4，其由上述的酯酶基因est4编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，上述的酯酶EST4能够用于催化短链酰基底物的水解反应，该短链酰基底物的碳原子的数目小于10。

一种重组质粒，其包含表达载体和上述的酯酶基因est4。表达载体可以优选为pLLp-OmpA。

一种基因工程菌株，其由上述的重组质粒转化大肠杆菌Top10F’获得，能够用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO：2的酯酶，该基因工程菌株的保藏编号为CGMCC No.10812。

其中，上述的基因工程菌株能够用于催化短链酰基底物的水解反应，该短链酰基底物的碳原子的数目小于10。

另外，上述的基因工程菌株还能用于催化多种芳香仲醇的动力学拆分反应。

此外，上述的基因工程菌株还能用于短链萜烯酯的催化生成反应。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明从深海污泥中提取了酯酶基因est4，并构建了含有该酯酶基因est4的基因工程菌株，从而实现了该酯酶基因est4的异源表达，所产生的酯酶EST4具有优良的酶学特性，催化水解温度范围为20-55℃，水解pH值为5.0-10.0，在45℃条件下保温12h仍能保持80％以上的残余酶活，在纯极性有机溶剂中保存12h仍然保持90％以上的残余酶活。本发明的酯酶EST4可应用于催化水解酯和酶法合成酯产品生产过程中，其中，基于转酯化反应，在高底物浓度条件下，该酯酶EST4已成功用于催化合成多种短链萜烯酯和动力学拆分多种芳香仲醇等反应中。

附图说明