[发明专利]检测三唑磷的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测三唑磷的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测蔬菜中三唑磷药物的残留量。

背景技术

三唑磷，又名三唑硫磷，英文通用名Triazophos，化学名称O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯。纯品为浅棕黄色液体，20℃时在水中的溶解度为30～40mg/L，可溶于大多数有机溶剂；对光稳定，在酸、碱介质中水解，140℃分解。三唑磷具有强烈的触杀和胃毒作用，杀虫效果好，杀卵作用明显，渗透性较强，无内吸作用，是一种中等毒、广谱有机磷杀虫剂、杀螨剂，兼有一定的杀线虫作用，已在我国水稻、棉花、蔬菜和苹果等作物上登记，主要用于防治粮食、棉花、果树、蔬菜等主要农作物上的许多重要害虫。由于三唑磷的应用效果好，相对甲胺磷等高毒农药其毒性低，因此，在农作物上应用较广泛。

然而，三唑磷的大量使用也给一些食用农产品及环境带来了残留问题。三唑磷属有机磷农药，中等毒性，对神经、肝、肾、心、肺及生殖系统等多脏器均有明显的毒副作用，其中毒主要机理是抑制胆碱酯酶的活性。欧盟规定三唑磷最大残留限量(maximumresiduelimit，MRL)为不得检出的农药品种；日本“肯定列表制度”中规定，除了小麦、大麦、黑麦、玉米、荞麦、其他粮谷、棉籽和棉籽油设定了最大残留限量，其余适用“一律标准”，即0.01mg/kg；我国国家标准《GB2763-2005食品中农药最大残留限量》中限定三唑磷的MRL为稻谷0.05mg/kg，棉籽0.1mg/kg，没有制定蔬菜中三唑磷的最大残留限量标准。因此，建立三唑磷残留的快速检测技术，加强监测、科学使用三唑磷，对于保障人类健康与食品安全，降低环境污染，减少对农副产品出口产生的影响等具有重要意义。

我国标准体系中提供的测定蔬菜中三唑磷的方法均是多残留检测方法，有国家标准(GB/T19648-2006、GB/T5009.218-2008、GB/T20769-2008、GB/T23204-2008、GB/T23205-2008、GB/T23376-2009)、行业标准(NY/T1379-2007、NY/T761-2008、SN/T1950-2007、SN/T0148-2011)和地方标准(DB34/T1076-2009)，涉及到的检测方法有液相色谱法、气相色谱法和色谱-质谱联用法。仪器方法具有灵敏度高、结果准确等优点，但是资金和人员等投入成本较高。本发明应用酶联免疫法，测定蔬菜中三唑磷药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测蔬菜中三唑磷药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、三唑磷标准品溶液、酶标二抗、三唑磷特异性抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为三唑磷偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗抗体。

所述三唑磷偶联抗原是由三唑磷半抗原与载体蛋白偶联得到，所述三唑磷半抗原是由三唑磷和乙酰氯反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述三唑磷特异性抗体是以三唑磷偶联抗原作为免疫原制备获得，所述三唑磷特异性抗体可为三唑磷单克隆抗体或三唑磷多克隆抗体，其中优选三唑磷单克隆抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是采用改良后的过碘酸钠法进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括三唑磷标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述三唑磷标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或液盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。