[发明专利]水蛭素抗凝血酶活性的测定方法

权利要求书

1.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS³，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1:5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。

2.如权利要求1所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数的测定方法如下：将足量的水蛭素与已知一定质量的凝血酶反应后，在交联剂BS³作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据第二混合体系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，进而得到有效凝血酶的质量，其与已知一定质量的凝血酶的质量比即为所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数。

3.如权利要求2所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将多组不同质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量且足量的凝血酶反应后得到一一对应的多组第一混合体系，从而得出多组水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。

4.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将一系列梯度质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量的凝血酶反应后，在交联剂BS³作用下进行交联反应，终止交联后得到一一对应的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合体系，经电泳后根据未反应的水蛭素、未反应的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的变化确定水蛭素抗凝血酶活性的范围。

5.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；

步骤二、向8个管中分别加入1.5μL交联剂BS³溶液，于室温下交联反应30min，所述交联剂BS³溶液由12.5mmol BS³和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；

步骤三、向8个管中分别加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；

步骤四、向8个管中分别加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后每管取10μL进行SDS-PAGE分析，得出标记为6-8的管中样品经SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的密度未发生变化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范围在标记为5的管与标记为6的管之间，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的质量为0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性为5000-6000ATU/mg。