[发明专利]一种修饰的重组人内皮抑素及其应用

说明书

本申请是200710131562.X的分案申请，属于生物制品制药技术领域，公开了一种修饰的重组人内皮抑素及其应用。该修饰的重组人内皮抑制素结构为：CH₃O‑(CH₂CH₂O)_m‑CH₂CH₂CH₂‑N^αH‑Endostar，中CH₃O‑(CH₂CH₂O)_m‑CH₂CH₂CH₂‑的重均分子量为20kD或40kD。该修饰的重组人内皮抑制素增强了体内稳定性，提高了血药浓度，延长了半衰期，抗内皮细胞增殖活性显著增加，从而能够减少给药剂量，降低给药频率，减轻病人身体痛苦及经济负担。该修饰的重组人内皮抑制素可用于制备抗肿瘤药物。

本申请是分案申请，原申请的申请号为200710131562.X，申请日为2007年9月5日，发明名称为“一种修饰的重组人内皮抑素及其应用”。

技术领域

本发明属于生物制品制药技术领域，涉及一种修饰的重组人内皮抑素及其应用。

背景技术

1971年，Folkman教授提出“肿瘤的生长依赖于新生血管生成”这一观点，通过阻断新生血管生成，就有可能控制肿瘤生长，达到遏制肿瘤侵袭、复发、转移的目的，从此开创了肿瘤治疗的新领域。

1997年，哈佛大学O’Reilly等发现小鼠血管内皮瘤细胞的培养基具有内皮细胞抑制作用，通过纯化发现该活性物质在一定浓度范围内(100ng/ml～600ng/ml)特异性对内皮细胞表现出剂量依从的生长抑制作用。通过N端氨基酸测序表明该物质为胶原XⅧ的C末端片段，分子量20kD左右，这个蛋白就被命名为内皮抑素(Endostatin，ES)。

研究表明内皮抑素能够有效控制非小细胞性肺癌、结肠癌、脑胶质瘤、纤维瘤、间皮瘤及淋巴瘤等各种实体瘤的生长、浸润和转移。目前，内皮抑素的获得都是通过基因工程的方法。由于真菌表达内皮抑素成本太高，人们更倾向于利用大肠杆菌作为表达体系，但这样表达出的蛋白存在复性率低等问题。为此，人们开始尝试对天然内皮抑素进行结构改造。其中罗永章等在天然Endostatin的N末端添加了9个氨基酸，不仅使ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名为恩度(Endostar)。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：

(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

Ⅲ期临床实验表明改造后的内皮抑素与化疗药物NP联用可能有一定的协同作用，可延长患者的肿瘤进展时间。

临床实验证实内皮抑素毒副作用很小，适合与放疗或化疗联用。但是内皮抑素作为小分子蛋白，性质不稳定，有研究表明，内皮抑素在缺氧条件下容易降解，当内皮抑素与内皮细胞在低氧环境下共孵育48小时后，含量会下降20％左右。而肿瘤内部恰是低氧环境，对于其活性的发挥很不利。另一方面，目前Endostar临床用药量很大，为7.5mg/m²，需要每天静脉滴注3～4小时完成给药。实验表明，给药方式为腹腔注射时，内皮抑素在2小时内清除。这些现象表明，内皮抑素在进入体内后，尤其是在发挥药效的肿瘤局部可能会被蛋白水解酶水解。如何对蛋白分子进行保护，防止酶解，降低清除率从而减少给药剂量是急待解决的问题。