[发明专利]两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系及其分离方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于医药生物领域，具体涉及两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系及其分离方法和应用。

背景技术：

乳腺癌是女性第一大恶性肿瘤，发病率逐年增高。据美国癌症协会(ACS)2012年数据统计，美国新增诊断病例23万，增长了29％，死亡病例4万，增长14％。我国随着生活方式改变，城市化进程加快，以及乳腺钼靶X线检查的推广，每年新检测出的病例逐年上升，中国上海乳腺癌发病率由1972年的17/10万升至2007年的69.22/10万。同时，中国乳腺癌的发病情况相对于西方国家呈现出年轻化的特征。大多数西方国家乳腺癌的发病高峰年龄出现在60岁以后。在中国，乳腺癌的发病高峰年龄则出现在45-50岁左右，提前了10至15年。其病理类型更趋向侵袭能力强的类型，愈后更差。地区分布上，患病率城市高于农城，经济发达地区高于经济落后地区。随着社会老年化，乳腺癌患者人数将更多，预计2011年我国乳腺癌新发病例110万，2021年达250万。这意味着在我国，乳腺癌已经严重危害了广大处于事业和家庭巅峰时期的女性的生命和生活，成为威胁女性健康的“首要杀手”。其对人类健康的严重危害已引起了世界卫生组织和医疗界人士的高度重视。肿瘤干细胞具有干细胞特性，能进行自我更新和多向分化，对肿瘤的形成、生长、耐药、复发和转移起着决定性的作用，是肿瘤治疗的难点所在。具有自我更新和分化能力，在不断分裂过程中更有可能获得多次突变的机会而变成恶性繁殖的肿瘤细胞，从而产生肿瘤。而这些肿瘤干细胞又与肿瘤的耐药、复发和转移息息相关。因此，杀灭肿瘤干细胞已成为一种新的肿瘤治疗策略。然而，据我们所知，目前尚无任何实验室建立起可稳定传代的临床来源的乳腺癌干细胞系，故尔，迫切需要建立起临床来源的可稳定传代的乳腺癌干细胞系并应用于临床及科学研究。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，其特征在于，是通过以下方法分离得到的：

(1)、取用刚切除的乳腺癌肿瘤标本，先经胶原酶消化处理，再过滤；

(2)、流式细胞仪分选出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的细胞，调节要求细胞纯度在98％以上；

(3)、配置乳腺癌干细胞培养剂，将步骤(2)中分选出的细胞经单克隆筛选后接种于含有乳腺癌干细胞培养剂的超低粘附的培养皿中，在原代培养中加入青霉素及链霉素双抗，于CO₂培养箱培养即得到两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系，分别命名为XM322和XM607。

步骤(1)所述的经胶原酶消化处理，优选使用胶原酶III，每毫升组织液中加入250单位胶原酶III，再置于37℃恒温培养箱中培养4小时。

步骤(1)所述的过滤，优选使用40mm滤网进行过滤。

步骤(2)所述的乳腺癌干细胞培养剂，优选，其配方为：在无血清DMEM-F12中加入10ng/mL碱性成纤维生长因子、20ng/mL表皮生长因子、2％B27及5ug/mL胰岛素。

步骤(2)所述的单克隆筛选，优选方法为：按重度1：2有限稀释法稀释至单一细胞，并将细胞分散滴加于96孔板中，显微镜下观察确认为单一细胞者进一步培养。

步骤(3)中所述的青霉素，其添加量优选为100U/mL，所述的链霉素，其添加量优选为0.1mg/mL。

步骤(3)所述的CO₂培养箱，优选为5％CO₂培养箱。

所述的流式细胞仪分选出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的细胞按现有技术常规操作。

本发明的第二个目的是提供两株可稳定传代并保持原特性的乳腺癌干细胞系在制备治疗乳腺癌药物中的应用。