[发明专利]白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

 本发明属于分子生物学技术领域，属于真菌品种的检测方法，具体的说是涉及白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

近年来，随着人类环境、疾病等方面的改变，真菌类感染的发病率呈现逐年上升的趋势。假丝酵母属（Candida Berkhout）是酵母菌中最大的一个属，包括163个种，约占目前已知酵母菌种数的 1/3；白假丝酵母菌亦称白色念珠菌，是导致真菌感染的重要致病菌之一。白假丝酵母菌广泛分布于自然界，以及正常人体的皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道等处，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病菌。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白假丝酵母菌就会繁殖并改变生长形式侵入人体细胞从而引起疾病。随着获得性免疫缺陷综合征、肿瘤等疾病发病率的上升，以及免疫抑制剂、抗生素及侵入性治疗的广泛应用，使白假丝酵母菌成为常见的感染病原菌。

白假丝酵母菌细胞呈卵圆形，致病性菌株细胞呈现假菌丝。该菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，以 37℃或室温孵育 2～3d 后，生成灰白乳酪样菌落；涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。若接种于4％玉蜀黍琼脂上，室温孵育3～5d可见假菌丝，芽生孢子，厚膜孢子。白假丝酵母菌对热的抵抗力不强，加热至 60℃，1h后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。

白假丝酵母菌引起浅表性感染和深部感染，引起的相关疾病有皮肤念珠菌病，包括指趾间糜烂，多见于长期从事潮湿作业的人、念珠菌性间擦疹多见于小儿和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多见于肥胖儿童、念珠菌性甲沟炎、甲床炎等多见于指甲；粘膜念珠菌病，多见于婴幼儿患者的鹅口疮以及生殖器念珠菌病；而深部感染疾病则包括内脏念珠菌病，该感染可累及全身所有内脏器官，其中以肠念珠菌病及肺念珠菌病较常见。此外还可引起泌尿道炎、肾孟肾炎、心内膜炎及脑膜炎等，偶见其引发念珠菌性败血症。念珠菌疹，即念珠菌及其代谢产物引起的皮肤变态反应，主要损害为成群的无菌性水疱，多见于手指间；也可见到银屑病样、玫瑰糠疹样、脂溢性皮炎样、荨麻疹样、离心性环状红斑样损害。

由此可见，开展白假丝酵母菌快速检测方法的研究具有十分重要的意义。目前有关白假丝酵母菌快速检测的方法主要分为2种：

1）以微生物培养为主的传统检测方法。首先增菌培养，取供试液10ml直接或处理后接种至适量的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48～72h。然后取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48h，必要时延长至72h，根据菌落形态初步判定。

2）以定性PCR和实时定量PCR检测方法为基础的分析法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，微量、特定的目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察鉴别，具有快速、灵敏等优点。

然而，上述2种检测方法存在检测周期长、检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测等问题，且需要专业人员操作；PCR仪价格在5万元左右，扩增需要2～3小时，电泳检测需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性。因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的检测方法。

环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、容易普及、安全可靠的优点，可是目前尚未有将LAMP法应用于快速检测白假丝酵母菌的试剂盒。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒以及一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的白假丝酵母菌的恒温基因扩增检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，其包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；

外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；

内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；