[发明专利]一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法与应用

权利要求书

1.一种CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，首先提取血液基因组DNA，将其稀释后通过PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列，PCR扩增产物纯化后将对应的序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。

2.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）DNA提取：提取方法参照TIANampBloodDNAkit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至100μg/mL；

2）PCR扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3及CYP2C19*17所在序列：PCR反应体系中组分及体积份数分别为Q5^?Master Mix12.5份，双蒸水8.5份，ward1份，Reverse1份；准确量取PCR反应体系23μL，向其中加入2μL稀释后DNA模板；置PCR管放于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：98℃，3 min；2：98℃，10 sec；3：58℃，30 sec；4：72℃，1 min；5：往复进行35个循环 ；6：72℃，5 min；7：25℃ ；

3）PCR扩增产物纯化：取2体积份的ExoSAP-IT和3体积份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分装到新的8连管中，每管加入PCR扩增产物2μL，混匀微离心，按以下程序进行反应：1：37℃,15 min ；2：80℃,15 min 3：4℃；

4）SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系中组分及体积份数分别为SnaPshot ReadyMix 2.5份；5×sequencing buffer 1份；Primers Mixer   2份；ddH2O 3.5份；其中引物混合物，比例如下：SNE_CYP2C19*2：SNE_CYP2C19*3：SNE_CYP2C19*17=1：1：3；准确量取SNaPshotPCR反应体系9μL，向其中加入1μL步骤3）得到纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCR1：96℃，10 sec；2：55℃，5 sec；3：60℃，30 sec；4：往复进行25 个循环；5：4℃ ；

5）SNaPshotPCR产物纯化：向SNaPshotPCR产物中加入1μLSAP酶，按以下程序进行反应：1：37℃，60 min ；2：75℃，15 min ；3：4℃；

6）SNaPshot分析：步骤5）获得的产物经 ABI 3100-XL基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号，通过GENEMAPPERIDV4.1软件分析确定SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测 SNP 位点处碱基变化确定基因型。

3.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测位点包括CYP2C19*2: c.681G>A(p.Pro227=)(SNP:rs4244285); CYP2C19*3:c.636G>A(p.Trp212Ter)(SNP:rs4986893);CYP2C19*17:c.806C>T(SNP:rs12248560)。

4.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述PCR中扩增CYP2C19(*2)的引物对如下：正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC；反向引物为：CTTCTCCATTTTGATCAGGA。

5.根据权利要求1所述的CYP2C19(*2、*3、*17)基因多态性SNaPshot检测方法，其特征在于，所述PCR中扩增CYP2C19(*3)的引物对如下：正向引物：GCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA；反向引物为：ACTTCAGGGCTTGGTCAATA。