[发明专利]脐带血单个核细胞来源的DC-CIK细胞制取方法及制剂

权利要求书

1.一种DC细胞制取方法，其特征在于将分离自脐带血的单个核细胞分别进行分化成成熟的DC细胞。

2.根据权利要求1所述的DC细胞制取方法，其特征在于先由GM-CSF、IL-4和Flt3L因子分化24小时～48小时获得未成熟的DC细胞，然后再由TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2作用于所述未成熟的DC细胞24小时～48小时，获得所述的成熟的DC细胞。

3.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的GM-CSF用量为20ng/ml～30ng/ml。

4.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于IL-4用量为10ng/ml～20ng/ml。

5.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的Flt3L用量为45ng/ml～55ng/ml。

6.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的TNF-α用量为95ng/ml～105ng/ml。

7.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的IL-1β用量为5ng/ml～15ng/ml。

8.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的IL-6用量为5ng/ml～15ng/ml。

9.根据权利要求2所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的PGE2用量为0.3μg/ml～3μg/ml。

10.根据权利要求1所述的DC细胞制取方法，其特征在于获取所述的成熟的DC细胞步骤包括：

将4×10⁶个/ml～5×10⁶个/ml取自脐带血的单个核细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育2小时后吸出悬浮细胞，清洗贴壁细胞，于培养基中加入因子GM-CSF至浓度25ng/ml，加入IL-4至浓度16ng/ml和加入Flt3L至浓度50ng/ml分化24小时～48小时，期间保持GM-CSF、IL-4和Flt3L终浓度稳定，获得未成熟的DC细胞；

再使用100ng/mlTNF-α、10ng/mlIL-1β、10ng/mlIL-6和1μg/mlPGE2作用于所述的未成熟的DC细胞24小时～48小时获得所述的成熟的DC细胞。

11.根据权利要求10所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的培养基为以无血清淋巴细胞培养液为基础培养基。

12.根据权利要求10所述的DC细胞制取方法，其特征在于所述的培养基为以无血清淋巴细胞培养液为基础培养基，还加入脐带血血浆至浓度0.5v/v～1v/v％。

13.一种根据权利要求1～12所述的方法获得DC细胞在制备肿瘤的免疫治疗药物中的应用。

14.一种根据权利要求1～12所述的方法获得DC细胞与CIK细胞共培养。

15.一种根据权利要求1～12所述的方法获得DC细胞与CIK细胞按1∶10～100共培养。

16.一种DC-CIK共培养细胞制取方法，其特征在于将权利要求1～12所述的方法获得的DC细胞与分离自脐带血的单个核细胞分化成的CIK细胞进行共培养，获得DC-CIK共培养细胞。

17.根据权利要求16所述的DC-CIK共培养细胞制取方法，其特征在于所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离，经红细胞裂解液裂解后，用生理盐水清洗，低速离心后获得。

18.根据权利要求16所述的DC-CIK共培养细胞制取方法，其特征在于所述的DC细胞和CIK细胞由来自同一份脐带血单个核细胞的贴壁细胞和悬浮细胞分别培养得到。

19.根据权利要求16所述的DC-CIK共培养细胞制取方法，其特征在于所述的DC细胞和CIK细胞按1∶10～100进行共培养，培养时间为7天～10天，保持IL-2浓度95ng/ml～105ng/ml稳定。

20.根据权利要求16所述的DC-CIK共培养细胞制取方法，其特征在于获得的DC-CIK共培养细胞具有CD3+和CD56+免疫表型。