[发明专利]纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌

权利要求书

1.一组在检测中配对使用的抗体，由保藏编号为CGMCC No.10312的杂交瘤细胞分泌的抗单增李斯特菌单克隆抗体1B12和由保藏编号为CGMCC No.10311的杂交瘤细胞分泌的抗单增李斯特菌单克隆抗体3B10 组成，所述杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2015年1月15日。

2.一种纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：应用链霉亲和素-生物素介导偶联的纳米磁珠标记经杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌特异性反应鼠系单抗制备成纳米免疫磁珠；同时以胶体金标记的另一抗单增李斯特菌的配对单克隆抗体为标记抗体，选择新西兰大白兔免疫的抗单增李斯特菌多克隆抗体和山羊抗小鼠IgG二抗分别作为检测线T区和质控线C区的包被抗体，经过胶体金标记抗体的结合垫、检测线T区和质控线C区的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗体夹心检测原理的单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条；检测样品时，将纳米免疫磁珠与样品中的菌体进行特异性的捕获并富集，再在胶体金免疫层析试纸条的样品垫上加入富集液体，依据胶体金的颜色在检测线T区域和质控线C区域处形成肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速定性检测；

所述的胶体金试纸条制备方法如下：

（1）胶体金的制备：取0.01%HAuCl₄水溶液100mL置于烧杯内，加热煮沸时加入2mL 1%柠檬酸三钠，继续加热煮沸5min, 冷却后加超纯水至100mL，制得40nm的胶体金溶液；

（2）结合垫的处理：将制备出的另一株与磁珠偶联抗单增李斯特菌单克隆抗体1B12 CGMCC No.10312配对的抗单增李斯特菌的单克隆抗体3B10 CGMCC No.10311标记于胶体金颗粒上，使其终浓度为25μg/mL，使标记液体喷点在结合垫上以备用；

（3）层析膜的包被：用自动喷膜仪，以 0.9µL/cm的速度，将特定浓度的抗单增李斯特菌多克隆抗体、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0.8cm;包被后的层析膜于37℃的干燥箱中烘干8小时，置于干燥器中保存备用；

（4）试纸条的组装与制备：将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次相互交错约1mm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖密封膜;根据要求宽度切割即可得到胶体金免疫层析试纸条。

3.根据权利要求2所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述的纳米免疫磁珠的制备方法如下：

（1）抗体的制备与纯化：以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化；

（2）纳米免疫磁珠与抗体的偶联：采用活泼酯的方法，将180nm磁珠与链霉亲和素偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化抗体与链霉亲和素磁珠连接制成纳米免疫磁珠，具体步骤如下：洗涤磁珠，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺、EDC，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h；将活化的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素磁珠，再将其与生物素化的单增李斯特菌单克隆抗体1B12 CGMCC No.10312，置于混匀仪上偶联，形成纳米免疫磁珠，并于4℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述的纳米免疫磁珠捕获富集菌体方法如下：取样品与自制的纳米免疫磁珠在旋转混合仪上室温反应，反应后进入磁场分离，经重悬、水浴即可得到菌体富集液用于下一步胶体金试纸条的检测。

5.根据权利要求4所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，将待测样品富集液滴入检测卡加样孔，待5~15分钟后读取T、C线的显色，得到结果。