[发明专利]一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，特别是一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法。

背景技术

菲律宾蛤仔Ruditapes philippenarum俗称花蛤、蚬子，属双壳纲，帘蛤科，蛤仔属，为广温、广盐性种类，宜养面积广，是我国四大养殖贝类之一，其产量占海水贝类总产量的31％。2010年，我国蛤仔养殖产量约300万吨，约占世界总产量的90％。菲律宾蛤仔养殖风险小、投资少、相对成本低、产量高，产业地位十分重要。

目前我国海水养殖的菲律宾蛤仔基本上都是野生型的，难以适应逐渐恶化的养殖环境。因此，利用生物技术培育优良的养殖品种，是当前乃至未来发展海水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。以多倍体诱发技术为主的贝类细胞遗传技术是目前贝类遗传育种中最活跃和最具应用价值的一个领域。由于三倍体贝类可育性较差，消耗极少能量用于繁殖，而更多的能量用于生长，导致三倍体贝类比正常二倍体生长速度快、成活率高、产量高。因此，通过染色体操作，诱导蛤仔三倍体，对蛤仔产业发展具有重要意义。

20世纪80年代以来，海水贝类的染色体操作得到广泛研究，主要通过两种方法诱导三倍体，第一，应用物理或化学的方法，阻遏PB2的排出，使PB2的一组染色单体留在受精卵内，形成三倍体；另外，通过四倍体个体与二倍体杂交，可以得到100％三倍体，已经用雄性四倍体与雌性二倍体杂交培育出全三倍体长牡蛎。

根据上述三倍体诱导机理，发展出多种多倍体诱导方法，通过抑制PB1释放可诱导四倍体和三倍体，抑制PB2的释放可得到三倍体。人工诱导多倍体的方法可分为物理学、化学、生物学三个方面。

物理学方法

在受精卵的细胞周期中施加物理因子处理，影响和干预细胞有丝分裂器的正常运作，以达到染色体加倍的方法。包括温度休克和静水压休克等。

化学方法

应用一些特殊的化学物质，阻遏细胞正常分裂，从而达到染色体加倍的目的。例如应用细胞松弛素B(CB)、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素、聚乙二醇、氰化钙等试剂。

生物学方法

在贝类培育上比较常用的方法就是用可育的四倍体与正常二倍体杂交，产生三倍体，三倍体率达到100％，并且操作方便，适用于大规模产业化水产养殖的需要，但目前，仅在牡蛎开发出可供繁育的四倍体成贝。

根据以上方法，已在30余种海水贝类中进行了多倍体的诱导，但仅牡蛎类实现了多倍体的产业化。国外曾研究菲律宾蛤仔的多倍体诱发，但诱导率较低，且不稳定，未能形成成熟的菲律宾蛤仔三倍体诱导技术。本发明通过大量科学试验，加强对精卵的选择，大幅度改进对受精卵的处理方法，建立了稳定、高效的菲律宾蛤仔三倍体诱导方法。

对菲律宾蛤仔的三倍体诱导有以下几个关键点：精卵充分发育，同步受精，提高受精阶段及胚胎发育阶段的同步性，对提高三倍体诱导率尤为重要；对受精卵处理时间、处理时长和处理强度的精确控制；外界因素，尤其是温度，对胚胎发育速度具有显著影响，因此有必要通过对极体的观察确定药物处理的时间节点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，实现对菲律宾蛤仔稳定、高效的三倍体诱导。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，包括步骤如下：

(1)蛤仔亲贝的选择及促熟：选取滩涂采捕亲贝，在室内升温促熟，达到性腺充分成熟；

(2)亲贝处理及配子排放；将亲贝置入砂滤海水中进行催产，然后将开始排放配子的亲贝选出，单个置于烧杯中排放配子，获得多杯卵液和多杯精液；

(3)卵液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯卵液中的每杯卵液，选择发育良好的多杯卵液进行合并，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入塑料烧杯备用；

(4)精液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯精液中的每杯精液，选取活力良好的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；

(5)同步受精，镜检及分组；取上述备用精子加入到上述步骤(3)的卵子悬浮液中，精卵比为3:1-5:1，然后将受精卵分成处理组和对照组；

(6)在处理组的受精卵中加入细胞松弛素B；观察对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的80％时，迅速向处理组加入细胞松弛素B至终浓度为0.5mg/L；