[发明专利]甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法

权利要求书

1.一种源于真菌的甲硫氨酸裂解酶的编码基因，其特征在于：其cDNA序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸。

2.含有权利要求1所述编码基因的重组表达载体。

3.按照权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组酵母表达载体。

4.含有权利要求2所述重组表达载体的重组宿主细胞。

5.按照权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述的重组宿主细胞是重组酿酒酵母细胞。

6.由权利要求1所述编码基因编码的甲硫氨酸裂解酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

7.一种生物合成权利要求6所述甲硫氨酸裂解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将甲硫氨酸裂解酶的编码基因克隆至酵母表达载体中，构建得到表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体；

(2)将所构建的表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体转化到酿酒酵母中，得到甲硫氨酸裂解酶的表达菌；

(3)诱导甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶，收集诱导表达后的菌体，破碎菌体，纯化所表达的重组甲硫氨酸裂解酶。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将SEQ ID No.1所示的核苷酸通过HindIII和BamHI双酶切定向克隆至酵母表达载体pYES2，得到过表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体pYES2-STR3；

步骤(2)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母INVSc1；

步骤(3)中所述的诱导甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶的方式为用半乳糖诱导表达甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的重组酵母表达载体pYES2通过以下方法构建得到：

以黑孢块菌的基因组为模板，用SEQ ID No.3为上游引物和SEQ ID No.4为下游引物扩增编码甲硫氨酸降解酶的基因，将其克隆至pYES2表达载体上，获得重组酵母表达载体pYES2-STR3；

步骤(3)中所述的诱导的条件为：诱导前菌液OD600为0.4，按w/v计，半乳糖的浓度2％，诱导表达温度为30℃，诱导时间为16小时。

10.按照按照权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的纯化的方法包括如下步骤：清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱，用柱平衡缓冲液Lysis Buffer进行柱平衡；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液Lysis Buffer重悬，超声破碎，离心取上清以进行上样结合；上样完毕后，用含20mM咪唑的洗脱缓冲液将柱上的非特异性杂质洗去；用含200mM咪唑的洗脱缓冲液收集目的蛋白；将收集的目的蛋白过脱盐柱进行纯化并收集，得到纯化的甲硫氨酸裂解酶。

11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于：柱平衡缓冲液组分为：20mM Tris-HClpH＝8.5，300mM KCl，10mM imidazole，10％glycerol，1mM PMSF；洗脱缓冲液组分为：20mMTris-HCl pH＝8.5，300mM KCl，20mM imidazole，10％glycerol，1mM PMSF。

12.权利要求6所述的甲硫氨酸裂解酶在降解甲硫氨酸中的应用。