[发明专利]一种猪瘟脾淋源复合活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪瘟脾淋源复合活疫苗的制备方法。

背景技术

猪瘟（CSF）是国际动物卫生组织（OIE）和中国的A类法定传染病，是我国强制性免疫的重大动物疫病之一，是危害我国养猪业的“第一杀手”。猪瘟是由猪瘟病毒引起的，无法用药物进行控制，疫苗免疫是最有效的办法。

目前国内外市售的猪瘟疫苗主要有猪瘟脾淋苗、猪瘟细胞苗以及猪瘟亚单位疫苗，但市场上猪瘟疫苗的主流产品仍然是猪瘟脾淋苗和猪瘟细胞苗。作为疫苗中的经典-精制猪瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。

猪瘟脾淋源活疫苗选用中国猪瘟兔化弱毒株（C株），该疫苗株能激发机体快速产生免疫力、遗传稳定、毒力不返强，是国际上公认的目前世界上最为安全有效的弱毒疫苗株。采用该毒株接种优良家兔，收获感染家兔的脾脏制成乳剂，与冻干保护剂混匀后经过冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源活疫苗。

目前市场认为猪瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，对猪瘟脾淋活疫苗的认识仍存在误区，这主要和目前国内猪瘟脾淋源活疫苗使用方法不当、混合感染猪只免疫后应激过大，以及质量参差不齐等情况有关。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力，同时多糖也具有很好的耐热效果，多种实验表明中药多糖可作为耐热保护剂添加于活疫苗冻干保护剂中。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

抗原抗体复合物疫苗是上世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照适当比例与抗原混合而成。抗原抗体复合物疫苗中抗体主要起着延缓病毒释放的作用，疫苗注射后，免疫复合物会被存在于脾脏的一种称为树突状淋巴细胞所捕获，继而抗原会缓慢释放。当母源抗体下降到疫苗可以出破的水平时，此时释放的疫苗抗原即可在靶器官定植，从而诱导免疫力。其优点在于安全性高，免疫效果比常规疫苗好；可突破母源抗体干扰，仔猪使用该类疫苗对其他疫苗免疫无干扰作用。

传统的抗原抗体复合物疫苗制作方法是将高免血清与法氏囊病毒结合，该方法制备疫苗所需大量高免血清抗体，需通过屠杀大量动物获得，费时费力，同时生产成本较高，导致疫苗价格较昂贵。

卵黄抗体的研究始于19世纪末20世纪初。1889年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年,Jukes的实验证明了母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中,从而为雏鸡提供被动免疫保护。

卵黄抗体（IgY）分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心(ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集到一定量时再进行大规模地提纯IgY。