[发明专利]一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法

权利要求书

1.一种人源碱性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，其特征在于，该载体表达框两侧序列分别为克隆自烟草叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S片段；在靠近trnA-23S片段的是权利要求1所述的目的基因bFGF基因，其由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止子TpsbA终止，构成目的基因表达框；而靠近16S-trnI片段的分别是作为报告基因的绿色荧光蛋白基因GFP和作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因aadA，依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体终止子Trps16之间，构成多顺反子的表达框；命名为pWX-Nt03。

3.一种携带并可扩增权利要求2所述的载体的宿主细胞Mach1。

4.一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产如权利要求1所述的人源碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、构建如权利要求2所述的烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03；

步骤2、bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选，得到烟草叶绿体转bFGF基因的同质化植株；

步骤3、叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析；

步骤4、纯化重组人源碱性成纤维细胞生长因子，得到烟草叶绿体表达的碱性成纤维细胞生长因子。

5.根据权利要求4所述的利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于，所述步骤1中构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03具体为：

1.1)、在保持氨基酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编码基因的所有密码子采用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列再通过DNAMAN7.0和Vector NTI 10.0软件分析其中的酶切位点信息，将第35位氨基酸Ile的编码密码子由第1最适密码子TAT，变更为第2最适密码子TAC以消除EcoR I酶切位点；将第104位氨基酸Tyr的编码密码子由第1最适密码子TCT，变更为第2最适密码子TCA以消除Psi I酶切位点；将第109位氨基酸Ser的编码密码子由第1最适密码子ATT，变更为第2最适密码子ATA以消除Xba I和Bgl II酶切位点；优化后的人源碱性成纤维细胞生长因子基因序列见SEQ ID NO.1所示；

1.2)、构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03，经密码子优化后的人源碱性成纤维细胞生长因子基因bFGF，由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止子TpsbA终止，构成目的基因表达框，作为报告基因的绿色荧光蛋白基因GFP和作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因aadA依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体终止子Trps16之间，构成筛选标记表达框；上述两个表达框化学合成后，通过酶切连接导入来自烟草叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S片段两段同源片段之间，最终获得用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03。