[发明专利]一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法

说明书

本发明涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：选用pPIC9K‑G‑CSF(15‑75)‑GS115工程菌做菌株进行发酵培养；发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；对过滤后上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；对疏水层析产物进行阴离子交换和凝胶过滤，最后所得的G‑CSF(15‑75)的纯度达到99％以上，比活性达到了1.5×10⁸IU/mg，为G‑CSF(15‑75)的工业化大生产奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法。

背景技术

粒细胞刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)具有促进粒系造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能的作用。它能够在骨髓移植中促进中性白细胞的增殖，并对癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏症，以及再生障碍性贫血伴随的中性粒白细胞缺乏症有明显的疗效。

John F.Reidhaar-Olson研究发现G-CSF的Leu15，Glu19，Gln25，Leu31，Lys34，Lys40，Leu47，Val48，Leu49，Leu54对蛋白活性起重要作用。二硫键对于蛋白受体二聚化，激活下游信号传导有重要作用，发明人构建的G-CSF多肽(15-75)覆盖G-CSF活性重要的氨基酸序列，含有完整的二硫键，利于保持其活性。但现有技术的纯化方法应用于所述G-CSF多肽(15-75)，纯度较低。

发明内容

本发明提供一种重组粒细胞刺激因子G-CSF(15-75)多肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：

1)选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；

2)发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；

3)对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；

4)对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液；

5)对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞刺激因子多肽。

所述步骤1)的工程菌为保藏号为CGMCC NO:10713的巴斯德毕赤酵母菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年4月13日，分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

所述步骤3)的疏水层析其柱填料为phenyl sepharose 6 fast flow(high sub)，具体实施步骤为：

样品预处理：接收步骤2)所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体NaCl或者硫酸铵调节cd至50ms/cm。

平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；

上样：上样时泵流速为8.0-18.5ml/min，上样结束后用平衡缓冲液复平衡5个柱床体积；

洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集主峰。

步骤3)所述的平衡缓冲液为10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0，加固体NaCl调节cd50ms/cm；所述的洗脱缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5。

所述步骤4)的阴离子交换其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯，具体实施步骤为：