[发明专利]一种用于黄曲霉毒素B1富集分离的适配体-磁性纳米粒子制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素B1样本的净化处理工艺，具体涉及一种黄曲霉毒素B1分离的适配体-磁性纳米粒子制备及应用方法。

背景技术

黄曲霉毒素B1均为黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，具有致癌、致畸、致突变的作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件都不易破坏，因此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。各国对食品中黄曲霉毒素残留量现状非常重视，制定了相应的限量标准，如我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为(B1+B2+G1+G2)10ng/g。

目前，黄曲霉毒素B1的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，多为一次性的，使得分析成本较高、耗时长、选择性低，严重制约了分析方法的发展。

有关对磁纳米粒子进行修饰，并应用于磁性纳米分离试剂的研究已有报道。磁性纳米粒子具有较大比表面积，易于利用氨基、环氧基等官能团进行化学修饰，经修饰后的磁性纳米粒子能够与被测试样品相结合，再利用外加磁场，使磁性纳米粒子可以快速从复杂的样液中分离。

申请号为CN102680673的专利申请公开了一种将黄曲霉毒素B1抗体与磁性微粒偶联，制备出具有特异性的免疫磁性微粒，用于样本中黄曲霉毒素B1净化。该发明改善了分离效率，但同样存在抗体的不足，不易保存，再生后效率低等缺陷。核酸适配体作为一种人工筛选的特异性DNA或RNA片段。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，并且核酸适配体作为识别分子在蛋白质研究、药物检测、医学诊断和食品安全等方面得到了广泛应用。

然而，单独的磁性纳米粒子并不具有对目标物的特异性识别。因此，对于复杂样品中微量的黄曲霉毒素B1的高选择、快速、有效的分离是亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的提供一种用于黄曲霉毒素B1分离的适配体-磁性纳米粒子复合物，进一步地，本发明还提供一种用于黄曲霉毒素B1分离的适配体-磁性纳米粒子复合物的制备，更进一步地，本发明还涉及一种用于黄曲霉毒素B1分离的适配体-磁性纳米复合物的应用，以解决背景技术中黄曲霉毒素B1样品净化分离操作复杂、分离效率低等问题。

本发明首先提供一种用于黄曲霉毒素B1分离的适配体-磁性纳米粒子复合物，包括如下结构：

(1)由顺磁性的Fe₃O₄磁纳米粒子构成内核层；

(2)包覆内核层的硅烷化层，所述的硅烷化试剂为3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷；

(3)外壳层表面为黄曲霉毒素B1适配体的修饰层，黄曲霉毒素B1适配体的序列为：5’-NH₂-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’。

进一步地，本发明还涉及一种用于黄曲霉毒素B1的适配体-磁性纳米粒子复合物的制备方法，它包括了以下步骤：

(1)通过共沉淀技术、制备出Fe₃O₄磁纳米粒子，在外加磁场下，洗涤纳米粒子，冷冻干燥；

(2)使用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷在甲苯体系中对步骤(1)的磁纳米粒子表面进行修饰，得到修饰了环氧官能团的磁纳米粒子，用乙醇和甲苯反复洗涤除去未反应的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷；

(3)使用PBS缓冲溶液超声分散所述步骤(2)得到的磁纳米粒子，加入黄曲霉毒素B1适配体，37℃孵育12小时，反应完成后，磁分离弃去上清液，所得磁性纳米粒子溶于1mol/L pH为8.0的乙醇胺中，封闭未反应的环氧官能团，40-50℃孵育4小时，反应完成后，磁分离弃去上清液，并用PBS缓冲溶液反复清洗，最终获得黄曲霉毒素B1适配体-磁性纳米粒子复合物。

本发明第三方面提供了.黄曲霉毒素B1适配体-磁性纳米粒子复合物的应用方法，包括步骤：

(1)按照上述的制备方法值得适配体-磁性纳米粒子复合物；

(2)样本用甲醇-水或乙腈-水进行提取，0.01～0.1mol/LpH7.4的PBS缓冲液稀释至有机溶剂比例少于10％(体积分数)；

(3)将上述步骤(2)稀释液与步骤(1)复合物进行反应，捕获黄曲霉毒素B1。磁性分离，弃上清。

(4)甲酸甲醇(1+99，v/v)或甲酸乙腈(1+99，v/v)作为洗脱液加入到步骤(3)得到的磁性纳米粒子，室温振荡，磁性分离，上清液为净化后黄曲霉毒素B1样本。