[发明专利]一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物,以及试剂盒有效

专利信息
申请号: 201510303935.1 申请日: 2015-06-04
公开(公告)号: CN105039516B 公开(公告)日: 2019-04-12
发明(设计)人: 聂玉强;李永强;杜艳雷 申请(专利权)人: 广州市第一人民医院;广州维伯鑫生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/689 分类号: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/145
代理公司: 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 代理人: 罗伟平;潘俊达
地址: 510000 *** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 艰难 芽孢 杆菌 毒素 基因 荧光 pcr 检测 方法 及其 引物 以及 试剂盒
【说明书】:

发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物,以及试剂盒,本发明的基因引物具有相应的特异性能好,长度合适,转录高效,不会形成二级结构,引物自身少于连续4个碱基的互补,采用本发明引物测试的符合率高达98.6%,测灵敏度可以达到100copies/mL。本发明检测方法,能够简单方便地提取出标本中的艰难梭菌DNA,如粪便标本,并对艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因进行检测,该方法使用特异性的扩增引物和荧光探针,使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强,从而避免了抗体及培养检测方法特异性不足,避免了误测的问题。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物,以及试剂盒。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌,对氧十分敏感,很难分离培养,故而得名。该菌发现于1935年,但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素(氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等)引起的伪膜性肠炎有关,方被重视。

艰难梭菌广泛分布于自然生境中,如土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)的粪便,及狗、猫、啮齿动物和人的粪便,除此之外还大量存在于水和动物的肠道中。婴儿的粪便中常含有艰难梭菌,为新生儿肠道中正常菌群,大约50%12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌,2岁以上儿童的带菌率大约为3%,但此菌在健康成人中出现频率较低,无症状带菌的成人在瑞典是1.9%,在日本为15.4%。

由于服用抗生素后,打破了肠内菌群的平衡,从而导致艰难梭菌累计了大量的数量,产生大量的外毒素A和B。外毒素A由肠道毒素和细胞毒素组成。外毒素可绑定黏膜细胞从而导致出血。而外毒素B是一种细胞毒素,在体内外毒素B不能与黏膜细胞直接绑定,因为外毒素B只能与破坏的细胞绑定,导致更大的破坏。大多数艰难梭菌种属都产生这两种毒素,从而在不同时期产生不同的作用,在初期外毒素A首先与黏膜细胞绑定,造成初级的破坏,然后外毒素B进而发挥更大的破坏。

基于Taqman探针法的一步法荧光定量实时PCR(Realtime Fluorescence RT-PCR)可以快速、灵敏、特异地检出目的RNA片段,已经逐渐成为RNA病毒检测的一个重要发展方向。通过实时记录探针标记基团受激发产生的荧光,实现了对PCR扩增过程实时监测,无需电泳检测,有效减少了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。而配合适当的buffer、引物、探针,可以使灵敏度达到低至10个以内拷贝的检测。

发明内容

本发明的第一个目的在于:提供一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物。

为了实现上述目的,本发明采用的方案如下:

一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物,所述的艰难梭状芽孢杆菌毒素包括艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B,所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQ ID NO.1,其下游引物核苷酸序列SEQ ID NO.2,其荧光探针引物核苷酸序列SEQ ID NO.3;

上游引物:tcdA-F:5’-GCAGTCGGATTGCAAGTAATTG-3’(SEQ ID NO.1);

下游引物:tcdA-R:5’-GTCTGCCAACCTTTTGAGATGAT-3’(SEQ ID NO.2);

荧光探针:tcdA-P:5’-VIC-ATTTCAATCCTGACACTGC-MGB-3’(SEQ ID NO.3)

所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQID NO.4,其下游引物核苷酸序列SEQ ID NO.5,其荧光探针引物核苷酸序列SEQ ID NO.6;

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