[发明专利]一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒

说明书

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒，本发明的基因引物具有相应的特异性能好，长度合适，转录高效，不会形成二级结构，引物自身少于连续4个碱基的互补，采用本发明引物测试的符合率高达98.6%，测灵敏度可以达到100copies/mL。本发明检测方法，能够简单方便地提取出标本中的艰难梭菌DNA，如粪便标本，并对艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因进行检测，该方法使用特异性的扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了抗体及培养检测方法特异性不足，避免了误测的问题。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法及其引物，以及试剂盒。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌，对氧十分敏感，很难分离培养，故而得名。该菌发现于1935年，但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素(氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等)引起的伪膜性肠炎有关，方被重视。

艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便，除此之外还大量存在于水和动物的肠道中。婴儿的粪便中常含有艰难梭菌，为新生儿肠道中正常菌群，大约50％12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3％，但此菌在健康成人中出现频率较低，无症状带菌的成人在瑞典是1.9％，在日本为15.4％。

由于服用抗生素后，打破了肠内菌群的平衡，从而导致艰难梭菌累计了大量的数量，产生大量的外毒素A和B。外毒素A由肠道毒素和细胞毒素组成。外毒素可绑定黏膜细胞从而导致出血。而外毒素B是一种细胞毒素，在体内外毒素B不能与黏膜细胞直接绑定，因为外毒素B只能与破坏的细胞绑定，导致更大的破坏。大多数艰难梭菌种属都产生这两种毒素，从而在不同时期产生不同的作用，在初期外毒素A首先与黏膜细胞绑定，造成初级的破坏，然后外毒素B进而发挥更大的破坏。

基于Taqman探针法的一步法荧光定量实时PCR(Realtime Fluorescence RT-PCR)可以快速、灵敏、特异地检出目的RNA片段，已经逐渐成为RNA病毒检测的一个重要发展方向。通过实时记录探针标记基团受激发产生的荧光，实现了对PCR扩增过程实时监测，无需电泳检测，有效减少了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。而配合适当的buffer、引物、探针，可以使灵敏度达到低至10个以内拷贝的检测。

发明内容

本发明的第一个目的在于：提供一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物。

为了实现上述目的，本发明采用的方案如下：

一种艰难梭状芽孢杆菌毒素基因的荧光PCR检测方法的引物，所述的艰难梭状芽孢杆菌毒素包括艰难梭状芽孢杆菌毒素A和艰难梭状芽孢杆菌毒素B，所述艰难梭状芽孢杆菌毒素A基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQ ID NO.1，其下游引物核苷酸序列SEQ ID NO.2，其荧光探针引物核苷酸序列SEQ ID NO.3；

上游引物：tcdA-F：5’-GCAGTCGGATTGCAAGTAATTG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：tcdA-R：5’-GTCTGCCAACCTTTTGAGATGAT-3’(SEQ ID NO.2)；

荧光探针：tcdA-P：5’-VIC-ATTTCAATCCTGACACTGC-MGB-3’(SEQ ID NO.3)

所述艰难梭状芽孢杆菌毒素B基因的荧光PCR检测方法的上游引物核苷酸序列SEQID NO.4，其下游引物核苷酸序列SEQ ID NO.5，其荧光探针引物核苷酸序列SEQ ID NO.6；