[发明专利]一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白的适配子

说明书

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白的适配子。

背景技术

DKK1编码一种分泌蛋白，其在脊椎动物发育至关重要的作用，并且是被称为Wnt信号通路的结肠癌细胞的负调节。DKKl是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制fct诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。fct通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor factor)和 SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK 家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKKl编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cysl、Cys2),能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low_densitylipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)结合，并在膜蛋白 Kremenl/2 参与下通过引起LRP5/6内吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6复合体的形成,而抑制经典的fct信号通路。已知在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKKl蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKKl，DKKl可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。而且，最新的研究表明ＤＫＫ１蛋白（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１）可作为肿瘤标志物用于肝细胞癌（ＨＣＣ）的血清诊断，可用于筛检甲胎蛋白（ＡＦＰ）阴性患者，对肝脏良、恶性疾病有较好的区分效用。因此，对DKK1蛋白进行特异性的检测具有较好的应用价值。

核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术（即系统进化指数富集技术）是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子（aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、 蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好， 稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、 筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。

核酸适配子筛选的基本步骤如下:设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合癌细胞中的DKKl蛋白，可以来实现癌的诊断与治疗。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个含有38个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链DNA适配子随机文库；以人DKKl蛋白其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性DNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表面抗原亲和力高、 特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合癌DKK1蛋白。所述适配子序列如下：