[发明专利]一种基于Ms7基因构建的多控不育表达载体及其用于保持和繁殖玉米隐性核不育系的方法

说明书

技术领域

一般地，本发明属于分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因Ms7的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。

背景技术

杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于它的两个亲本的现象。例如不同品系、不同品种、甚至不同种属间进行杂交所得到的杂种一代往往比它的双亲表现更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等的提高。这是生物界普遍存在的现象。通过利用杂种优势进行作物杂交育种，可以显著地提高作物的产量和品质。

      玉米是杂种优势利用的最成功的作物之一，目前玉米生产上的杂交种利用率已经达到100%。在玉米杂交制种过程中，母本的去雄技术是影响玉米杂交种制种成本和制种纯度的关键因素。人工去雄相对容易，还可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略也存在一些问题：一方面，这些技术大大增加了制种的成本，另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，最终导致很大的经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。

     玉米隐性核雄性不育材料不存在去雄的问题，但由于缺乏有效的保持和繁殖技术，很难应用于实际生产当中。现代生物技术的发展为玉米隐性核雄性不育材料的利用创造了条件。本发明旨在将玉米隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达元件、抑制雄配子体形成的基因表达元件、荧光蛋白标记基因表达元件和除草剂抗性基因表达元件串联起来，构建高效的玉米多控不育遗传转化表达载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Ms7基因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体（构建体）及其应用的方法。

本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件（4种不同类型表达盒的元件），这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地（通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性）用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。

本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。

（1）具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。

进一步，上述育性相关基因即玉米Ms7基因。

上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Ms7基因的启动子或组成型表达的Ubiquitin启动子。

5126启动子是玉米花药特异性启动子。

Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。

（2）抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体形成或功能的基因以及终止子。

具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zm13启动子；抑制植物雄配子体形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为In2-1终止子或PinⅡ终止子。

Pg47和Zm13都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的5’调节区(Allen和Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271)。玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1 基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃从而遏制花粉发育。

Dam甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res(1983)11: 837-851)的表达产物能催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化，经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。

终止子为In2-1终止子（玉米In2-1基因的终止子）或PinⅡ终止子（马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子，An et al., Plant Cell (1989)1: 115-122）。