[发明专利]活性羊膜保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学技术，属于羊膜保藏措施的改进，特别是活性羊膜保存方法。

背景技术

羊膜来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管与淋巴管且抗原性低的韧性组织。羊膜由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成，厚约0.02～0.05mm。羊膜上皮层为单层立方上皮，细胞表面及侧面有很多微绒毛，有合成、分泌和沉积基底膜、细胞外间质成份的能力，具有分化的潜能，并可以分泌多种生长因子；而羊膜基质含有丰富的胶元纤维及多种形式的蛋白酶抑制剂；羊膜基底膜是人体最厚的基底膜(约0.1μm)，含有IV型胶原纤维网、层粘连蛋白和富含硫酸肝素的蛋白多糖，可以起屏障作用，降低羊膜的通透性。

随着新生血管、炎症及伤口愈合等相关疾病的患者人数增多，羊膜的使用也越来越多。羊膜的制备，尤其是羊膜活性成分的保存措施，也就成为目前研究的一个热点。目前市面上采用的多为直接经过冷冻的干燥羊膜-生物冻干羊膜，它是将附有羊膜的纸片置于冻干机，在真空条件下用钴-60辐射烘干，并在室温下真空包装，室温下避光放置两个月，使用前需置于含庆大霉素的生理盐水中浸泡3min，但冻干羊膜组织结构及上皮比较容易被破坏，此方法操作相对简单，成本较低，便于规模化批量生产，可长期保存，运输方便，但需要用到特殊的设备，安全可靠性低，耗时长，效率低下，实施起来较为繁琐。现存的另一种干燥羊膜-海藻糖浸泡羊膜，它是将分离出的羊膜置于10％海藻糖溶液中浸泡，然后冻干，真空包装，射线辐照灭菌后避光保存，该方法保存的羊膜在形态学、生物学方面更接近于自然新鲜羊膜，但其效果尚未得到更多证实。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性羊膜保存方法，安全可靠性高，实施起来简捷高效。

本发明的目的是这样实现的：一种活性羊膜保存方法，①用含抗菌素的PBS浸泡无病毒且已先被漂洗过的新鲜生物羊膜，浸泡时间为5min-10min，再用PBS冲洗羊膜3次×5min，所述抗菌素包括5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素和100mg/L链霉素；②在无菌台上将羊膜上皮面朝上并平铺于纤维素膜上，在羊膜可承受的拉伸度范围内使羊膜展平；③自然晾干羊膜直至羊膜含水量在0.1％—5％之间后将其剪成（1cm-3cm）*（1cm-3cm）的矩形；④使甘油在121℃物理环境中灭菌20分钟后冷却且对保存瓶进行高温、高压与消毒；⑤将甘油与DMEM在容器中等质量混合均匀后分别将甘油与DMEM混合成的保存液等质量倒入保存瓶中；⑥将羊膜放入保存瓶装有的保存液中后，立即用酒精灯将热封条热封住保存瓶的瓶口，再将瓶口被热封住且内置被封存的浸泡有羊膜的保存液的保存瓶置于-80℃物理环境中冷藏。

注意事项：本发明所用的羊膜供体取自经顺产术获取的胎膜，在产妇术前的病毒学检验结果为阴性，其获得的胎膜在无菌洁净环境内用无菌生理盐（浓度0.9%氯化钠）水洗净存在于其表面上的血迹和污物，而且术者双手需戴无菌手套后使羊膜与绒毛膜上轻轻分离开来（即羊膜与绒毛膜钝性分离）然后在无菌BSS（BalancedSaltSolution）冲洗干净，最后将羊膜平铺在无菌玻璃平板上，用细胞刮子刮除其海绵层、纤维母细胞层及浆液性渗出液等。

本发明安全可靠性高，保证无污染，其保存的羊膜性能与新鲜羊膜接近，生物活性高，胶原破坏率少，易于手术操作，作为新鲜羊膜的替代物，取材方便，实施起来简捷高效，实用性强，能被广大患者接受并应用于临床。

具体实施方式

一种活性羊膜保存方法，①用含抗菌素的PBS（PhosphateBufferSaline）浸泡无病毒且已先被漂洗过的新鲜羊膜，浸泡时间为5min-10min，再用PBS冲洗羊膜3次×5min，所述抗菌素包括5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素和100mg/L链霉素；②在无菌台上将羊膜上皮面朝上并平铺于纤维素膜上，在羊膜可承受的拉伸度范围内使羊膜展平；③自然晾干羊膜直至羊膜含水量（质量比例）在0.1％—5％之间后将其剪成（1cm-3cm）*（1cm-3cm）的矩形；④使甘油在121℃物理环境中灭菌20分钟后冷却且对保存瓶进行高温、高压与消毒；⑤将甘油与DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium/培养基）在容器中等质量混合均匀后分别将甘油与DMEM混合成的保存液等质量倒入保存瓶中；⑥将羊膜放入保存瓶装有的保存液中后，立即用酒精灯将热封条热封住保存瓶的瓶口，再将瓶口被热封住且内置被封存的浸泡有羊膜的保存液的保存瓶置于-80℃物理环境中冷藏。

需使用活性羊膜时，将其从-80℃物理环境中从保存瓶内取出，置于常温下3-5min，保存液由固态变为液态后，方可取出被浸泡的羊膜使用，在-80℃时浸泡于被封存于保存瓶内的保存液中的活性羊膜一般保存寿命为2年。