[发明专利]用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物。

背景技术

枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

荧光实时定量 PCR(qRT-PCR) 具有操作简单， 成本较低， 灵敏度高的优势， 经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究， 其转录水平的研究常常基于qRT-PCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因， 在稳定或是病原应激的细胞中， 管家基因都能相对较稳定表达。 但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的 qRT-PCR 实验结果是非常重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物。本发明中的3对内参基因引物序列特异性扩增高，扩增效率接近，线性相关性好，可用于检测枯草芽胞杆菌168菌株中基因的表达量变化。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物，所述的引物序列为clsA F: GGGTCCAGAACGCTGAGAA，clsA R: AAAGCCTCCGACATAACCG；dnaN F: GCACTTGCCGCAGATTGA，dnaN R: AATGCAAGACGGTGGCTATC；rpoB F: TGTCCGCATTGATCGCAC，rpoB R: TCAAGCGTATTTCGCAGGTA。

本发明采用的3对内参基因引物，可作为多内参体系应用于荧光定量PCR检测。

一种枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因筛选方法，所述步骤包括如下：1）菌体总RNA的抽提、质量检测及cDNA合成；2）SYBR Green 实时定量PCR扩增；3）内参基因的筛选。

所述步骤1）中的具体步骤为：

(1)挑取枯草芽孢杆菌单菌落转接瓶中，加氯霉素至终浓度为5μg/mL，培养至对数期，OD₆₀₀为0.6时，加1mM IPTG诱导， 6小时后进行RNA的提取；

(2) 取2mL菌液，12,000rpm离心收集细胞，加入液氮研磨三次，研磨充分呈白色粉末状；

(3) 加入2mL Trizol至研钵中，并将研钵中的液体全部转移至离心管中；

(4) 将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；

(5) 加入0.4 mL 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4℃离心10 min；

(6) 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min；

(7) 12,000 rpm 4°C 离心10 min，弃上清；

(8) 加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清，室温干燥5-10 min；

(9) 加入30-50 µL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA；

(10)取适量RNA样品，加入10×Loading Buffer，100V电压下，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；

(11)将RNA进行合理倍数的稀释，测其A260及A280数值，检测RNA的纯度；

(12) 利用全式金公司的逆转录试剂盒，将RNA分别逆转录为cDNA，每一个逆转录体系中加1μg RNA，42℃逆转录15min，85℃ 5s，去除逆转录酶活性。

本发明的优点在于：