[发明专利]一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用。

背景技术

作物害虫是造成农业减产的重要因素之一,据联合国粮农组织统计,全世界每年因病虫害使谷物减产20％～30％,仅仅美国每年因虫害造成的皮棉损失达12％～14％,经济损失达4.5亿美元。传统的杀虫剂主要是一些天然或合成的化学药品,它们在短期内虽然能起到杀灭害虫保护农作物的作用,但长期使用会使毒性在植物体内积累,危害人类及其他动物健康,同时还能导致害虫对杀虫剂产生抗性,从而降低其药效,因此世界上很多国家都已禁止对农作物使用化学杀虫剂,而致力于生物杀虫剂的研究,并取得了重大进展。其中美国的Monsanto公司在生物工程的研究与开发方面起到了举足轻重的作用,1993年美国农业部批准300项转基因作物的田间试验,其中90项是由Monsanto公司提出来的。1989年美国种植转基因大豆0.1亿公顷,主要是由Monsanto公司提供的种子。使用生物杀虫剂可以克服化学杀虫剂的许多弊端,但用作生物杀虫剂的物质许多在自然界并不是大量存在的,通常情况下只是作为一些次生代谢物存在,这使得生物杀虫剂的造价昂贵。随着植物基因工程的兴起与发展,这一问题得到了很大程度的解决。人们将这些抗虫物质的基因克隆并转入植物体内,从而获得抗虫转基因植物。与常规的生物杀虫剂相比,抗虫转基因植物的优点更为显见,例如,它对植物具有连续保护作用,只对目标害虫起作用,而对非危害生物无影响,而且所表达的抗虫物质仅存在于植物体内,不存在环境污染问题；同时它的成本低,有利于推广。目前应用于转基因植物的抗虫基因主要有两大类,一类是来源于微生物的抗虫基因,另一类是来源于植物的抗虫基因,其他还有来源于动物的几种,但人们对此研究较少。寻找可用的抗虫基因资源就成了，发展转基因抗虫农业的关键。

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的块茎，是一种重要的中药材。半夏主要药理作用为内用可燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结；外用则主要用于消炎。近年来研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育和抗蚜虫等重要药理作用。

蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor，PI)是一类分子量较小的蛋白质，广泛的存在于动植物体中，能与体内蛋白酶结合，形成蛋白酶-蛋白酶抑制剂复合物，从而抑制蛋白酶的水解作用，调节机体很多重要的生命活动，包括蛋白降解、信号传导、炎症、凋亡和血液凝固等。植物蛋白酶抑制剂主要存在于种子器官或者块茎中，其含量往往可以到达总蛋白的10％。目前，豆科植物中大量的植物蛋白酶抑制剂已经被发现、分离纯化和探索，其生理作用和机制研究也已经研究的比较清楚。很多报道表明当植物叶片受到化学处理或者机械损伤时，也可诱导产生大量植物蛋白酶抑制剂。

根据蛋白酶抑制剂作用于蛋白酶活性位点的不同，可以将蛋白酶抑制剂分为四大类。其中植物中最多的是丝氨酸蛋白酶，尤其是在豆科植物中，该类蛋白酶抑制剂也是到目前为止研究最广泛、最深入的植物蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶家族又可以主要分为两个家族：Kunitz家族和Bowman-Birk家族。Kunitz蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另一个主要类型。该家族成员分子量一般为20kDa左右，肽链长度为180个氨基酸左右，分子内含有两对分子内二硫键，分子内部只有一个活性结合位点可与蛋白酶结合，因此这类蛋白酶抑制剂也被称为单头抑制剂。

不同的蛋白酶抑制剂在动植物体内的功能是多种多样的，目前，尚没有从半夏中分离出蛋白酶抑制剂并且研究其具体功能的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用。本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因具有明显的杀灭鳞翅目及半翅目昆虫的作用。

一种半夏胰蛋白酶抑制剂，所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。

所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因序列如序列表SEQ ID NO2所示。

一种含所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因载体。

含有所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因载体的宿主菌。

扩增所述的半夏胰蛋白酶抑制剂中任一片段的引物。

一种半夏胰蛋白酶抑制剂突变体，所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。

所述半夏胰蛋白酶抑制剂突变体的基因序列如序列表SEQ ID NO4所示。