[发明专利]一种大菱鲆肌肉细胞系的建立方法

权利要求书

1.一种大菱鲆肌肉细胞系的建立方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)原代细胞培养：将大菱鲆幼鱼的背部肌肉用DMEM培养基清洗后进行剪切，将组织块再用添加有抗生素的DMEM培养基进行清洗；

将清洗后的组织块用含有胶原酶的DMEM培养基进行消化，消化3-8min后，离心弃掉上清，使用DMEM培养基进行重悬清洗，离心后弃上清；

使用添加有胰蛋白酶的DMEM培养基对组织块再次进行消化，消化后离心，收集上清液；沉淀用完全生长培养终止胰酶消化，清洗后用完全生长培养基重悬沉淀，使用细胞筛过滤，收集过滤液后移入之前收集的上清液中；再次离心获得沉淀；

使用完全生长培养基重悬细胞沉淀，种入细胞培养平板中放入无二氧化碳的24℃培养箱中培养；

2)细胞传代

待细胞长满平板后进行传代，传代8次以后，将完全生长培养基中胎牛血清的含量降低为10％，传代30次后完成细胞系的制备。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有胶原酶的DMEM培养基，其中胶原酶的浓度为0.2％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的添加有抗生素的DMEM培养基，其中抗生素为青霉素和链霉素。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的青霉素的添加浓度为100单位/mL。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的链霉素的添加浓度为100μg/mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的完全生长培养基为含有20％胎牛血清，100unitsv/mL青霉素,100μg/mL链霉素，4.76g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2.5ng/ml成纤维细胞生长因子的L15培养基。