[发明专利]一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法，应用于基因治疗中的荧光成像跟踪。

背景技术

在过去的几十年里，基因递送和治疗已经受到世界各地研究学者的广泛研究。尽管病毒载体提供了更大的转染效率，但是在安全性方面具有很大的问题。因此，设计出在靶器官和组织中能实现安全、高效，并具有靶向性的高基因表达的基因载体是至关重要的，这不仅能实现基因进入细胞，并且能够示踪其在细胞内循环的路径。

近年来，关于药物输送和荧光成像已经得到了很好的研究，但是荧光实时示踪基因递送的研究还没有得到很大的研究。由于荧光蛋白、基因染料和纳米颗粒可以与基因通过共价键结合，因此可以作为荧光载体，但是，新的化学键的生成也许会破坏基因，导致低的甚至失去基因转染效率或者治疗作用。为了保持基因的序列和结构不变，选择一种新的基因运载方法至关重要。

由于基因上有大量的磷酸二酯键，因此基因序列是显示负电性的，我们选择带有正电性的载体通过静电作用与基因结合，将其载入体内，进行治疗作用。通过这种物理作用，基因的原始性质保持不变，并且能够得到高转染效率和基因治疗作用。目前，常用的基因运载体为聚合高分子，基因转染效率好(Wang,W.；Nan,W.J.；Sun,L.；Liu,W.G.,React.Funct.Polym.2013,73,993-1000.)，但是不能对基因运载过程进行实时示踪。因此对荧光材料进行表面正电修饰又成为一大亮点，通过配体交换得到亲水性正电荧光颗粒(Li,J.M.；Zhao,M.X.；Su,H.；Wang,Y.Y.；Tan,C.P.；Ji,L.N.；Mao,Z.W.,Biomaterials 2011,32,7978-7987.)，这些方法将无机油相颗粒转入水相的过程费时费力，配体交换修饰还会导致荧光性能降低。

因此发展新的合成方法，制备出分散性好、尺寸均一、荧光性能稳定、转染效率高的亲水性基因运载实时示踪器，这对病理诊断和基因治疗在临床上的潜在应用具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种亲水性基因运载实时示踪器及其制备方法。

本发明所述的亲水性基因运载实时示踪器是一种荧光纳米球，其形貌为均匀的球形，粒径在100-200nm范围，表面具有强正电荷；所述的荧光纳米球是在硫化锌掺锰量子点表面包覆带有正电的两亲性高分子；所述的带有正电的两亲性高分子的正电单体为氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑。

本发明所述的亲水性基因运载实时示踪器的制备方法，其具体步骤如下：

e.向反应釜中加入0.5-1.5mL氯仿、0.13-0.15g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.05-0.1g甲基丙烯酸、4.0-5.0g苯乙烯、0.01-0.2g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，80-120℃下加热反应8-12h；

f.待反应釜冷却至室温，然后加入甲醇得到沉淀，干燥后即为带有正电的两亲性高分子；

g.将0.1-1.0mg聚乙二醇、50-300μL硫化锌掺锰量子点的氯仿溶液、30.0-50.0mg步骤b得到的带有正电的两亲性高分子、0.60-0.95mL氯仿混合均匀后，倒入5-10mL的pH＝8.0-10的氢氧化钠水溶液中，超声乳化得到白色乳浊液；

h.将步骤c的乳浊液在45-65℃水浴中搅拌加热1-3h，待氯仿完全挥发后，自然冷却至室温，8000-11000r/min离心10-20min，最后将得到的沉淀分散到4-8mL超纯水中，即得到带有正电的亲水性基因运载实时示踪器。

上述的亲水性基因运载实时示踪器运载示踪基因的方法为：将亲水性基因运载实时示踪器与基因按质量比10:1-50:1在37℃培养箱中孵育1-5小时，通过静电作用得到亲水性基因运载实时示踪器与基因的复合体，该复合体与细胞37℃下共同培养。