[发明专利]鱼类线粒体全基因组DNA扩增

说明书

本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增。首先本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增的引物对，本发明还提供了利用上述引物组合来扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。通过本发明提供的扩增方法，能够成功地获得各种鱼类线粒体基因组的克隆产物。并且本发明设计和筛选得到的引物对具有扩增性能好、产生副产物较少等优秀性质。

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地涉及鱼类线粒体基因组DNA扩增的引物对以及扩增方法。

背景技术

鱼类线粒体基因组(mtDNA)是细胞质中具自主复制、转录和翻译能力的闭合环状双链DNA，包括一条重链和一条轻链。鱼类线粒体基因组主要包括37个编码基因(13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因)、1个负责复制和转录起始的控制区(D-loop)和1个轻链复制起始区。疏水蛋白基因编码的多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位:细胞色素b(Cyt b)、2个ATP合成酶的亚单位(ATPase6和ATPase8)、3个细胞色素c(Cytc)氧化酶的亚单位(COX1、COX2和COX3)和7个氢化辅酶I(NADH)脱氢酶的亚单位(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6)。2个rRNA基因为12SrRNA和16SrRNA基因。22个tRNA基因编码的氨基酸为:Pro、Thr、Glu、Leu、Ser、His、Arg、Gly、Lys、Asp、Ser、Tyr、Cys、Asn、Ala、Trp、Met、Ile、Glu、Leu、Val和Phe。

同核基因组相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。线粒体基因组能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tNA)和核糖体RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的。

鱼类线粒体中蛋白序列极为保守，几乎完全一样。如上所述的37个编码基因(13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因)，在鱼类中非常保守。但是这些蛋白所对应的核酸序列具有较高的突变率。同样，非编码基因区的保守性也非常低。大量研究表明线粒体DNA突变频率较核基因组高10倍以上。

线粒体基因组是一种位于核外的胞质遗传系统，几乎仅遵从母系遗传，一般不发生重组，父本线粒体在受精过程中被迅速降解或此后不久在复制时被丢失了。线粒体基因组有相对恒定的进化速率，因此在种内水平及种间水平的分子生态学特别是分子系统地理学的研究中，是广泛应用的主流分子标记。另外，线粒体基因组还是进行物种鉴定的重要资源。通过扩增获得未知物种的线粒体基因组，并与其他物种已有序列比对，可以了解该物种所属。

目前已经公开有针对鱼类线粒体部分区域的扩增方法，比如，针对线粒体COI序列的通用引物和扩增方法，和D-loop区域扩增引物及其设计方法。但是这些方法仅能获得鱼类线粒体基因组较短片段。

目前常用的鱼类线粒体DNA的一种扩增方法，是利用近源物种的mtDNA序列设计引物。该方法成功率较高，但是依赖于近源物种的mtDNA信息。

另一种常用的鱼类线粒体DNA扩增方法，是利用二代测序技术方法测序后组装。在提取核DNA和mtDNA后，对全基因组序列进行高通量测序并进行组装。这种方法不依赖于近源物种的mtDNA信息，对于未知物种的mtDNA比较有效。但是这种方法要求有高深度的基因组测序，成本高；同时，对全基因组组装技术要求较高；测序和组装结果主要是核基因组DNA。

考虑到扩增鱼类全长线粒体基因组的重要性，有必要开发一种全新的获得鱼类线粒体基因组的方法。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一种用于鱼类线粒体全基因组序列扩增的引物对。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：