[发明专利]羊水间充质干细胞的原代分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及羊水间充质干细胞的原代分离培养方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始未分化细胞，处于未定向分化状态并具有增殖能力。在特定条件下，干细胞可分化成不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。根据干细胞来源的不同可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和来源于出生后器官或成年个体组织的组织干细胞或成体干细胞(adult stem cell，ASC)。从来源看，要获取大量干细胞较困难。因此，寻找新的干细胞源成为热点。

近年研究表明：羊水(amniotic fluid，AF)中存在干细胞，可以分化为多种成体细胞，有望成为一种新的干细胞来源，且可避免ESC的伦理问题以及ASC的局限性。羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cell，AFS)可通过AF穿刺获取，较ESC易获取。羊水细胞比其它普通类型的细胞有着很多优点：首先，正常情况下羊水细胞在孕妇临产前就能够被提取。其次，羊水混合物中所包含细胞的“年龄”都比较小，因此这些细胞遭受周围环境引起的诱发突变的可能性就很小，从遗传学角度来说它们会更稳定。

羊水中含有较多类型的细胞，如内皮细胞等，在分离和培养的过程中需要去除。目前，对羊水干细胞的分选多采用免疫磁珠分选法，但该方法对细胞活性存在一定影响，且费用较高。还有些方法采用机械分离，但人为刮除内皮细胞的方法操作十分繁琐且极易引起污染，并且，极易造成细胞的损伤，导致细胞活性的降低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供羊水间充质干细胞的原代分离培养方法；本发明提供的方法利用差速贴壁原理，简化了操作，获得的干细胞纯度较高，活性良好，经传代后仍保持良好的干性。

本发明提供的羊水间充质干细胞的原代分离培养方法包括：

步骤1：明胶铺板后接种羊水组织细胞，培养11h～13h后转移培养液；

步骤2：将所述培养液培养至细胞融合率不低于85％，获得初步纯化的细胞；

步骤3：将所述初步纯化的细胞重悬，培养3h～5h后，更新培养基，继续培养至细胞贴壁，弃除培养液，获得羊水间充质干细胞。

本发明提供的方法，利用差速贴壁原理，在适宜条件下，使内皮细胞先贴壁生长。本发明准确控制培养时间，待内皮细胞贴壁完成后，转移包含羊水间充质干细胞的培养液。对培养液进行传代培养后获得羊水间充质干细胞。本发明提供的方法操作简单，无需更多的仪器，且无需人为刮除的操作，避免了细胞的损伤和污染。检测结果表明，步骤1中获得的培养液中所包含的羊水间充质干细胞的活力不低于89.28％，经传代3代，流式细胞检测结果表明，其表面抗体仍符合干细胞特性，未见分化趋势。

在本发明的实施例中，步骤1中接种的羊水组织细胞密度为5×10⁵个/mL。

在本发明的实施例中，步骤1中接种羊水组织细胞的量为2mL。

步骤1中接种密度和细胞量直接影响细胞增殖速率和贴壁效果，密度过高则内皮细胞不能完全贴壁，而密度过低则细胞贴壁速度过缓，影响细胞活力。

在本发明的实施例中，步骤1中培养的培养基为Lonza完全培养基；步骤1中培养的温度为37℃，5％CO₂、湿度为95％。

Lonza完全培养基包括：无血清培养基(Lonza UltraCULTURETM)、血清替代物(PALL Ultroser G)、谷氨酰胺和NEAA。

其中，血清代替物的质量分数为10％。

谷氨酰胺的质量分数为1％。

NEAA的质量分数为1％。

明胶可促进细胞贴壁，明胶铺板的方法为：向细胞培养板中加入质量分数为0.1％的明胶溶液，1mL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。

在本发明的实施例中，步骤1中所述培养的时间为12h。

在本发明的实施例中，步骤2中培养的时间为72h。

在本发明的实施例中，步骤3中重悬至细胞密度为1×10⁵个/mL。

在本发明的是实施例中，步骤3重悬采用Lonza完全培养基；步骤3中所述培养的温度为37℃，5％CO₂、湿度为95％。

在一些实施例中，重悬具体为：将初步纯化的细胞经胰酶酶解后，以Lonza完全培养基重悬。