[发明专利]Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法

说明书

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y‑27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法。本发明提供了Y‑27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。本发明通过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y‑27632能够促进间充质干细胞的增殖，本发明还提供了培养间充质干细胞的培养基和培养方法，实验表明，经培养五代后，与未添加Y‑27632的对照组相比，添加Y‑27632的实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31.87％；羊膜间充质干细胞的数量提高30％，骨髓间充质干细胞的数量提高27.27％。

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法。

背景技术

ROCK信号通路抑制剂Y-27632的CAS NO.为146986-50-7，分子式为C₁₄H₂₁N₃O·HCl，相对分子量为320.3，是一种高效的Rho相关的卷曲蛋白形成丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(ROCK)家族的小分子特异性抑制剂，能选择性的抑制ROCK1(p160ROCK)和ROCK2，IC₅₀(半数有效浓度)值分别为140nmol和800nmol；并且，Y-27632也抑制PRK2，其IC₅₀为600nmol/L。其抑制作用是通过与ATP竞争结合催化位点来实现的.现有技术表明，Y-27632的功能主要包括以下几个方面：1、选择性的抑制平滑肌钙离子敏感性并阻断其收缩，阻止Rho诱导的、p160ROCK介导的细胞张力纤维的形成；2、降低几种高血压大鼠模型的血压；3、保护艾氏腹水癌小鼠免于肿瘤的形成；4、阻止肝癌肝内转移。

人间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人羊膜间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用，在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研究应用中具有重要意义。

人间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中。目前，骨髓间充质干细胞的应用最为广泛。不同来源的干细胞的生物学特征存在相似之处，例如，都成纤维样形态生长，具有强大的体外扩增能力，都能像不同的组织分化。但是，不同来源的干细胞之间生物学特征还存在着差异：

骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMMSC)志物除表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族。

人羊膜间充质干细胞(human amnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC),来源于胎盘的羊膜组织的间质层，形态学类似于骨髓间充质干细胞。hAMSC的表面标志物除表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族外，还表达胚胎干细胞类的表面标志物，这些因子的阳性表达说明hAMSC的增殖能力比BMMSC要强。hAMSC不表达HLA-DR、CD14，弱表达HLA-ABC，且不表达共刺激银子，CD80、CD83、CD86、CD40L，这表明hAMSC具有较低的免疫原性。且研究表明，hAMSC能表达多种比骨髓源MSC表达更丰富的造血细胞因子，例如：IL3细胞因子。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesnchymal stem cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低。研究表明，分离后的脐带血淋巴细胞和单核细胞百分比分别为60.56％和17.93％，明显多于骨髓血46.75％和10.70％。分离后脐血干细胞的CD34、CD38明显多于骨髓血干细胞，分别为5.7:1.6和2.4:1.6。