[发明专利]HSV-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HSV-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用。

背景技术

基因敲除技术广义的定义是将生物细胞基因组某基因去除或使基因失去活性的技术，包括将某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲出的目的。

目前病毒基因敲除的方法基本上都是抗性基因替换法，即用一段编码抗性基因的外源片段，通过同源重组替换病毒基因组内的目的基因，然后通过空斑纯化的方法进行病毒的筛选，获得突变病毒株。但利用此方法进行基因敲除成功率太低，空斑纯化过程非常耗时耗力，并且由于直接涉及到活病毒操作，还给实验带来一定的危险性。因此如果开发出一套更加高效简便的体外病毒基因敲除的方法，毫无疑问会得到广泛的应用，促进对HSV病毒各基因功能的研究。

发明内容

为了克服现有技术中病毒基因敲除方法周期长、成功率低、空斑纯化工作量大，且涉及到活病毒操作，存在潜在的危险性等缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种HSV-1病毒体外基因敲除系统，该系统用于体外病毒基因敲除高效、简便。

本发明的另一目的在于提供上述基因敲除系统的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述基因敲除系统的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种HSV-1病毒体外基因敲除系统，为含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞；

所述的BAC-HSV-1载体为载有HSV-1病毒全基因组的细菌人工染色体；

所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的载体；

所述的阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点可分别诱导Cre-recombinase重组酶和重组限制性内切酶I-SecI的表达；

所述的重组限制性内切酶I-SecI可识别I-SecI识别位点，并在此位点切开，此过程会造成DNA双链的断裂，引起DNA的损伤；

所述的细菌细胞优选为EPI300E.Coli细菌；

所述的pREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的pKD46载体；

所述的HSV-1病毒体外基因敲除系统的制备方法，包含如下步骤：

(1)pREDI重组载体的构建：

①根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到启动子PrhaB编码基因的DNA片段；

②根据重组限制性内切酶I-sceI编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段；

③通过重组PCR连接步骤①扩增得到的启动子PrhaB编码基因的DNA片段和步骤②扩增得到的重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段，获得PrhaB-I-SecI片段；

④将PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组载体；

(2)含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞的构建：

将步骤(1)制备得到的pREDI重组载体转入含有BAC-HSV-1载体的细菌细胞中，获得含有BAC-HSV-1载体和pREDI重组载体的细菌细胞，即为HSV-1病毒体外基因敲除系统；

步骤(1)①中所述的PCR扩增引物优选为：

PrhaB-F：5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3'；

PrhaB-R：5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3'；

步骤(1)②中所述的PCR扩增引物优选为：

I-SceI-F：5'-TTA GAC TGG TCG TAA TGA AAT TCA GCA GGA TCA CAT CTG GGT C-3'；

I-SceI-R：5'-CAT GCC ATG GGT CGA CTT ATT ATT TCA GGA AAG TTT CGG AGG AGA TAG TG-3'；

步骤(1)③所述的重组PCR的扩增引物优选为：