[发明专利]耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用

说明书

本发明属于基因工程和生物能源技术领域，具体涉及一种耐高温异淀粉酶基因克隆、表达及在酶生物燃料电池中的应用。该淀粉酶DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp。该耐高温异淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.1KDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序；编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域。该耐高温异淀粉酶可用于酶生物燃料电池。本发明优势在于：异淀粉酶耐高温、酶活力稳定，具有很强工业应用潜力；用于糖燃料电池时，可使淀粉类物质彻底水解为葡萄糖，从而提高能量转化效率，拓展生物燃料电池的应用范围。

技术领域

本发明属于基因工程和生物能源技术领域，具体涉及一种耐高温异淀粉酶基因克隆、表达及在酶生物燃料电池中的应用。

背景技术

生物燃料电池是以有机物为原料，利用细胞或酶将化学能转化为电能的一类绿色燃料电池。根据催化剂种类可分：微生物燃料电池和酶生物燃料电池，它们具有能量转化效率高、生物相容性好、原料来源广泛、成本低廉且环保等优点，在医疗、电子、环境保护等领域均有重要的使用价值。但目前大部分的生物燃料电池输出功率密度较低，极大限制了在生产中的应用。微生物燃料电池由于对电子屏蔽作用明显和较多副反应导致对燃料使用效率较低，而酶生物燃料由于催化剂浓度较高并且没有传质壁垒，因此有可能产生更高的输出功率，在室温和中性溶液中工作，满足一些微型电子设备或生物传感器的需求。另外，与甲醇燃料电池相比，糖分（淀粉或葡萄糖）驱动的酶燃料电池因原料成本低廉，生物可降解性更强，更绿色环保而获得研究者青睐。最新研究表明：在不消耗ATP前提下，通过人工合成的多酶催化途径，可以实现淀粉水解为葡萄糖和葡萄糖彻底氧化偶联技术，这有力推动了高能量密度的酶燃料电池的发展，为淀粉类原料在酶燃料电池中的应用提供了很大可能性。但针对淀粉类原料中的支链淀粉和麦芽糖糊精，由于存在大量糖苷键分支位点（如图1所示），在α-葡聚糖磷酸化酶作用下，水解为葡萄糖-1-磷酸效率偏低，造成能源浪费和酶燃料电池能量密度的降低。针对支链淀粉和麦芽糖糊精，异淀粉酶或普鲁兰酶可以将支链淀粉和麦芽糖糊精中的α-1，6糖苷键水解，切下整个侧枝，形成直链淀粉，极大提高了α-葡聚糖磷酸化酶水解支链淀粉的能力。但是，目前已发现的普鲁兰酶或异淀粉酶都存在稳定性差，不耐热等问题，限制了此类酶在工业中的应用。所以，耐高温异淀粉酶的发现和应用对提高新型淀粉燃料电池作用至关重要。

发明内容

本发明主要目的是提供一种耐高温异淀粉酶基因序列，同时提供该序列所表达蛋白的制备方法及该蛋白在酶生物燃料电池中的应用。

本发明所采取的技术方案如下。

一种耐高温异淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp，该基因从KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库中的Sulfolobus tokodaii基因组中筛选获得，其代码为：ORF ST0928。

所述耐高温异淀粉酶基因所编码耐高温异淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.1KDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序（CBM）；编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域；编码序列546~716为未知功能多肽；该酶在本发明申请之前被推定为一种糖原脱枝酶，本申请则经过验证证明其为耐高温异淀粉酶。

所述耐高温异淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）基因克隆，通过设计引物，应用PCR技术扩增或人工合成方法得到包含异淀粉酶基因全长序列；

设计引物序列设计如下：

IF：5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，