[发明专利]一种切除筛选标签的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种切除筛选标签的方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产，具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目标产物的生产水平，具有非常重要的意义。

随着分子生物学技术的不断进步，功能基因组学以及菌株的基因工程改造变得越来越重要。近年来，大量组学数据的不断公布，功能基因组学研究以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点，而且还会用到多种研究策略。而筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件，外源DNA需要与筛选标签一起整合到基因组上，然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标签非常少，无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重要的分子遗传操作工具，其原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上，催化重组反应，使得位于靶位点之间的DNA片段被剔除。基于此，在被成功应用于筛选标签的切除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β-rec/six系统和Flp/FRT系统，但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中导入重组酶表达元件，通过诱导等方式在细胞内表达出重组酶，并作用于识别位点对筛选标签进行切除。pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因)是一种与尿嘧啶营养缺陷性菌株搭配使用的营养选择型标签，基于pyrG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征，筛选标签存在与否都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用，会使得筛选标签的剔除更加高效、易行。

发明内容

为解决土曲霉遗传操作过程中可用筛选标签数量有限，导致基因打靶技术在土曲霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种切除筛选标签的方法，使筛选标签可循环利用，遗传改造不再受筛选标签不足所限制，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种切除筛选标签的方法，该方法是以染色体上整合了pyrG筛选标签的重组菌为出发菌，利用位点特异性重组系统切除pyrG筛选标签使菌株能再次作为出发菌使用pyrG筛选标签进行遗传转化。

优选地，所述出发菌，为土曲霉(Aspergillus terreus)。

更优选地，所述出发菌，为敲除了ku80基因或lig4基因的土曲霉。

优选地，所述染色体上整合了pyrG筛选标签的重组菌，pyrG筛选标签的两侧带有同向的loxP序列。

优选地，所述pyrG筛选标签源于曲霉，更优选地，来源于黑曲霉。

优选地，所述位点特异性重组系统，为Cre/loxP位点特异性重组系统；所述切除pyrG筛选标签，是切除两侧带有同向loxP序列的筛选标签pyrG。

优选地，所述Cre/loxP位点特异性重组系统，Cre重组酶的用量为2-9U。

所述方法的步骤如下：

1)以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉为受体菌，以源于黑曲霉的两端带有同向loxP位点的pyrG基因表达元件loxP-pyrG1-loxP作为筛选标签进行回补实验，获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标签的重组菌；

2)制备步骤1)中所述重组菌的原生质体，以DNA为辅助载体向原生质体细胞中导入2-9U的Cre重组酶进行筛选标签切除，通过筛选尿嘧啶营养缺陷型的方式筛选loxP-pyrG1-loxP筛选标记被切除的重组菌。

优选地，所述方法的具体步骤如下：

1)分别敲除土曲霉CICC 40205的ku80基因和pyrG基因，构建尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG；

2)以黑曲霉Co827的pyrG基因表达元件pyrG1为筛选标签，通过分子克隆的方式在两侧加上同向的loxP序列，获得两端带有同向loxP位点的pyrG筛选标记loxP-pyrG1-loxP，以步骤1)所构建的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG为受体菌，以loxP-pyrG1-loxP为筛选标签进行回补实验，获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标签的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；