[发明专利]一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及基因组序列的扩增方法。

技术背景

剑状矛蚌(Lanceolaria gladiola)隶属于瓣鳃纲蚌科矛蚌属，软体动物，栖息于我国湖泊、河流及池塘的沙泥底中，贝壳坚厚，中等大小，壳前端有颗粒状的花纹，贝壳多呈灰褐色，外形窄长，呈剑状。长度约为高度的4.5倍。蚌类具有一定的经济价值，如培育珍珠，发展我国的珍珠养殖业，提取抗肿瘤成分，许多贝壳较厚的种类可作为制造纽扣贝雕等工艺品的原料，一些贝壳闪亮的珍珠层可以用来制造各种精美的螺细、器皿和家具等。此外，淡水贝壳的石灰质可作为家禽的饲料，软体部分可供食用，是肉食性鱼类的良好饲料，对水环境中Cu、Zn和Cd有去除与积累的作用，吸收富集重金属，改良水质。蚌科动物是淡水贝类最大的一个科，包括674个物种，淡水蚌类是淡水生态系统中一类重要的水生生物，作为滤食者，能够通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来改良水质，对水环境还有生物监测的作用。淡水蚌类在淡水生态系统中不可或缺，其生物量和密度往往都在底栖动物中占优势，对淡水生态系统有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水蚌类消失，将会引起一系列的生态问题。总而言之，淡水蚌类对淡水生态系统至关重要，对水体的水质、物质循环和能量流动作用巨大，且具有较高的营养、经济和生态价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法。为了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。

本发明所述方法包括下列步骤：

(1)提取蚌的总DNA；

(2)利用保守引物分别对cox1、16SrRNA和nad1基因进行普通PCR扩增并测序；

(3)根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序；

(4)序列拼接；

(5)基因注释。

所述的长片段引物包括以下三对：

COI-16S-F：5'CGTAACAGCCCAAACAAATA 3'

COI-16S-R：5'CAGAGGTACAAGAAAAGGTAAAGT 3'

16S-NDI-F：5'TGGGGCAATCTTGGAACC 3'

16S-NDI-R：5'GCTATAAACAGGAAAGCAAAACC 3'

NDI-COI-F：5'TAGTCTCAGGGTTCAACATCG 3'

NDI-COI-R：5'CACTCTGGGGCTTCGGT 3'。

本发明首次公开了剑状矛蚌的线粒体基因组，也是首次公开了一种扩增剑状矛蚌线粒体基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研究和种质资源保护提供重要的基础材料。

线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子(如原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进化等多方面的研究，与线粒体和线粒体基因组相关的研究已成为临床医学、进化生物学、基因组学、生物信息学等生命科学领域的研究热点和前沿。

蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种特例——双单亲遗传现象(Doubly-Uniparental Inheritance,DUI)。这种遗传方式使后代中雌性mtDN只来自母系(female-transmitted,F type)，与严格的母系遗传相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA(male-transmitted,M type)。

本发明的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对剑状矛蚌F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了剑状矛蚌F型线粒体基因组全序列。本发明获得的剑状矛蚌F型线粒体基因组序列总长15732bp，可从组成和结构的角度对剑状矛蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为蚌类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。

具体实施方式