[发明专利]一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其涉及检测法检测法的构建方法及应用。

背景技术

大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中含有的一些能引起人或畜禽发生过敏反应大分子蛋白质或糖蛋白。其中，大豆球蛋白(Glycinin)是大豆中主要抗原蛋白之一。畜禽生产中，摄入含有大豆的日粮后能够引起仔猪和犊牛等幼龄动物呈现腹泻、生长受阻、肠粘膜细胞增生等过敏反应的现象普遍存在。随着大豆及其制品广泛应用于人类食品和动物饲料行业，建立快速检测大豆抗原蛋白的方法势在必行。

目前，大豆抗原蛋白的检测方法有很多，例如，蛋白质免疫印迹(Western Blot)具有高特异性和敏感性等优点，但是在试验的过程中具有耗时长，成本高等弊端，因此在一些常规的生产检测中受到了限制。PCR技术(Polymerase Chain Reaction)，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，但在后期在使用DNA含量、质量和提取量等等技术过程中都会使PCR技术受到影响，因此就阻碍了此项技术发展和推广。HPLC(高效液相色谱法)在使用上比较消耗时间并且仪器相对昂贵，不适合实际生产中的应用，以上方法均具有一定的高效性和敏感性，但费用高，耗时长，不适于生产中大量样品的快速分析。

酶联免疫吸附试验，具有操作简单、快速、灵敏度高，特异性强，适合批量检测等优点已得到了广泛的认可，目前常见的方法有双抗夹心法和竞争法，但这些方法在抗体和蛋白标准品的使用量上无形的增加了检测成本。

因此本发明通过建立直接ELISA法来检测大豆球蛋白，除了节约检测成本外，检测步骤也较其它ELISA法简化，可以达到快速、 低成本的批量样品检测，此方法可应用于食品及饲料行业中过敏蛋白的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，得到大豆球蛋白的直接ELISA检测法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，包括以下步骤：

⑴包被抗原的获取：用包被缓冲液稀释不同浓度的大豆球蛋白,在聚苯乙烯板的反应孔中加100μl，4℃过夜，洗涤，获得包被抗原；

⑵封闭：每孔加入封闭液于37℃进行封闭，封闭时间为1～2h，洗涤；

⑶加样：加入不同浓度的大豆球蛋白特异多隆抗体与相应的抗原结合，每孔100μl，置37℃孵育1h，洗涤。

⑷加酶标二抗：将辣根过氧化酶标记抗兔IgG用抗体稀释液稀释成不同的浓度，取100μl加入不同反应孔中，37℃，酶标二抗作用时间为1～3h，洗涤；

⑸加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃，底物液作用时间为15min～25min；

⑹终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl；

(7)绘制标准曲线。

所述包被抗原的最佳包被浓度为1μg/ml，大豆球蛋白特异多隆抗体的最佳稀释为1：800倍稀释，所述稀释液为碳酸纳缓冲液，所述封闭液为1％的牛血清蛋白，所述封闭时间为60.42min，所述酶标二抗作用时间为149.63min，所述底物液作用时间的最佳组合为15.03min。

本发明同时提供上述大豆球蛋白的直接ELISA检测法的应用，包括以下步骤：

将待测大豆球蛋白溶液先后与大豆球蛋白特异多克隆一抗，将酶标记抗兔IgG作为酶标二抗反应，再加入底物液显色，利用标准曲线检测大豆球蛋白溶液中大豆球蛋白含量。

本实验以简单、快捷、灵敏，成本低等作为试验宗旨建立直接ELISA法，并优化了检测条件。通过优化结果显示，过大豆球蛋白直接ELISA检测法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、价格低廉、周期性短等特点，适于快速批量的定性或定量检测，可广泛应用于食品及饲料行业中过敏蛋白的检测。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。

图1为最适包被抗原浓度的筛选曲线图。

图2为最适包被抗体浓度的筛选曲线图。

图3为具有免疫活性的大豆球蛋白含量检测标准曲线图。

具体实施方式