[发明专利]一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法及专用培养基

权利要求书

1.一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，其特征在于，其组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。

2.一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、葡萄开花后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl₂浸泡8分钟，无菌水漂洗3次；

步骤2、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养；合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；

步骤3、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；

步骤4、幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上，体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；

步骤5、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养3-4周后，将获得的体细胞胚接种在TL+0.2mg/L IBA培养基上，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，令其萌发成苗；每4周继代一次，2月内获得具有正常的根、茎和真叶的体细胞胚离体再生植株；

步骤6、将离体条件下根系发育良好的植株经温室炼苗后用清水洗净其上附着的琼脂，移栽入装有营养土的营养钵内，成活后的幼苗进行常规管理，发育成健壮的葡萄植株；

所述TL培养基的组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。

3.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤3中胚珠在合子胚发育培养基上培养条件为：25℃弱光条件下，光照强度800Lux，光照时间16h/d。

4.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤4中幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。

5.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤5中胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。

6.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述体细胞胚在TL+0.2mg/L IBA培养基上培养条件为：25℃光照条件下培养，光照强度2000Lux，光照时间16h/d。