[发明专利]鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP引物组及LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测沙门氏菌(Salmonella)的LAMP试剂盒，属于微生物检测领域。

背景技术

沙门氏菌属(Salmonella)是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一，也是肠杆菌科中最复杂的菌属，属革兰氏阴性菌。目前全世界已分离出2523个血清型，我国已发现216个。沙门氏菌的多种血清型可以引起中毒，以鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌和肠炎沙门菌最常见。沙门氏菌中毒的症状主要由急性肠胃炎为主，潜伏期一般为四至四十八小时，短期是数小时，长期是两天至三天，前期症状有恶心、头疼，全身乏力和发冷等，主要症状有呕吐、腹泻、腹疼，粪便以黄绿色水样便，有时带脓血和黏液，一般发热的温度在三十八摄氏度至四十摄氏度，重病人出现打寒战、惊厥、抽搐和昏迷的症状。

传统检测沙门氏菌的培养方法，需要分离、培养和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般检测周期为4～6d，费时费力，且灵敏度低、特异性差。PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，已有较多应用于沙门氏菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此急待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床病原微生物检验方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新的等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果、反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点，特别适合病原微生物的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组、试剂盒，以及利用LAMP引物和试剂盒检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法。

为解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：

本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，其特征在于所述引物组包括两条外引物和两条内引物，鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因。

本发明所述的鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测引物组，其特征在于所述引物的序列如下：

F3：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG

B3：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG

FIP：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC

BIP：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC

一种鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含本发明所述引物组。

本发明所述鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括Bst DNA聚合酶大片段、LAMP 10×buffer、6mol/L甜菜碱、4mol/L dNTP、SYBR-Green染料。

本发明所述鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括阴性对照和/或阳性对照。

本发明所述鼠伤寒沙门氏菌特异性LAMP检测试剂盒，其特征在于所述阴性对照为PET28空载体质粒，所述阳性对照为插入了鼠伤寒沙门氏菌限制酶II基因的重组T载体。

本发明提供一种使用所述引物组或试剂盒特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法。

本发明所述特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法，其特征在于所述LAMP反应体系中dNTP的终浓度为0.2-0.6mol/L、甜菜碱的终浓度为0.4-1.2mmol/L。

本发明所述特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP方法，其特征在于所述LAMP反应在60-65℃恒温下进行45-75min。

本发明提供的快速检测沙门氏菌LAMP试剂盒可对沙门氏菌进行检测，适应于在基层兽医疾病防控机构或普通养殖场推广。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

灵敏度高、特异性好，能够快速准确的鉴定样本中的鼠伤寒沙门氏菌。

检测要求的设备条件低，结果直观，肉眼观察即可判断。

附图说明