[发明专利]一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

阿魏酸(ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植物中的一种酚酸。具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸，必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的强度。但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此，阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的应用潜能。

自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用，该菌株不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力基本不变。

一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.8672。

本发明所述的地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，土样采集及处理

土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。

取5-10g土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80℃水浴加热15-30min，期间每隔5min中震荡一次。

步骤2，富集培养

取1-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养20-24h。然后取1-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10％的富集培养基二中，继续在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养18-20h。

富集培养基一：酵母提取物0.5g，KH₂PO₄ 0.1g，NH₄NO₃ 0.1g，NaCl 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，微量元素1mL，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH4.0。

富集培养基二：NH₄NO₃0.5g，尿素0.1g，KH₂PO₄0.1g，NaCl 0.1g，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH3.0。