[发明专利]一种鹿茸骨膜组织的转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

动物组织转基因技术已经发展多年，常见的技术有通过向生殖细胞，胚胎注射外源基因及病毒载体等构建全身转基因的动物，或者通过构建含组织特异性启动子的病毒载体，获得组织特异性转基因动物。但是上述方法有如下弊端，首先是转基因的不确定性，通过生殖细胞/胚胎导入外源基因获得全身转基因动物，外源基因是随机整合的这就导致转基因的不确定性，随之整合的基因可能会影响动物内源基因的正常功能而影响动物的健康；另一方面随机整合也不便于在特定组织中分析某一或某些基因的功能或者获得组织特异性的目的基因的表达，例如哺乳动物器官生物反应器的获得。其次，组织特异性转基因动物建立的条件太苛刻，该方法获得转基因的先决条件是存在某种组织特异性启动子，并对其加以改造从而获得组织特异性转基因的效果。但是绝大数的基因的表达在空间序列上不具备组织特异性，甚至可能是全身表达的。另外在时间序列上这种限制也非常明显，某些基因只在动物某个组织的发育的特定阶段表达，在此时间节点之前、之后绝不表达。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，该方法是利用脂质体包裹携带外源基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

所述方法的步骤如下：

1)利用脂质体包裹携带有外源基因的病毒质粒，再将包裹好的病毒质粒与包装细胞293t一同孵育，孵育结束后获得含病毒颗粒的转染细胞液；

2)收取步骤1)所得的转染细胞液，离心除去破碎细胞后，收集上清液超滤浓缩获得病毒液，保存备用；

3)采集鹿茸骨膜组织，切割鹿茸骨膜组织后置于含有培养基的培养板中备用；

4)将步骤2)所得的病毒液制成病毒感染液并感染到步骤3)所得的鹿茸骨膜组织，感染后培养，获得感染组织；

5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

优选地，步骤1)所述病毒质粒，是慢病毒质粒，分别是质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev；所述脂质体，是脂质体Lipofectamine 2000。

更优选地，所述质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev，按照1:1:1:1的质量比进行包裹，添加量为3μg。

优选地，步骤1)所述孵育，是在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h，孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基。

优选地，步骤2)所述超滤浓缩，使用0.45μm滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4℃、5000g的条件下离心30min。

优选地，步骤3)所述鹿茸骨膜组织，是鹿生茸区鹿茸骨膜组织；所述切割鹿茸骨膜组织，鹿茸骨膜组织的切割厚度为0.18-0.22mm；所述含有培养基的培养板，是每孔含有200-400μLDMEM的6孔培养板；培养基含有10％FBS和100U/mL双抗。

优选地，步骤4)所述将病毒液制成病毒感染液，是吸干病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每1mLDMEM培养基中含有10％FBS，100U双抗，10μg助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32×10⁷TU/mL；所述感染是在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液1次，连续感染3周。

所述方法的具体步骤如下：

1)利用脂质体Lipofectamine 2000包裹携带有外源基因的病毒质粒Pll3.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE，pRSV_rev，再将上述包裹好的病毒质粒与包装细胞293t在37℃，5％CO₂的条件下孵育5h孵育使用的培养基是含有10％FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10％FBS、1％谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基，孵育结束后获得转染细胞液；