[发明专利]一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法

权利要求书

1.一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）选取植物幼嫩组织，破碎后，向破碎材料中加入酶解液混匀，在黑暗条件下震荡酶解植物幼嫩组织的细胞壁；

（2）酶解后过滤，收集滤液，清洗，离心，弃上清，获得原生质体悬浮液，并在原生质体悬浮液中加入水解酶以保持细胞壁纤维素的低水平再生；

（3）将加入水解酶的原生质体在亚低温或亚高温条件下温浴，温浴结束后，加超纯水以降低溶液渗透势，定时测定原生质体的直径；

（4）用步骤（3）获得的原生质体的直径值，计算多个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值，该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值差值越大，说明其亚低温或亚高温耐受性越差；

步骤（1）中所述的酶解液为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2~3%w/v，离析酶R-10的浓度为0.5~1%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1~5mL：0.2~2g；

或步骤（1）中所述的酶解液为纤维素酶、离析酶R-10和果胶酶的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2.5~3%w/v，离析酶R-10的浓度为0.5~1%w/v，果胶酶的浓度为0.1~0.2%w/v，甘露醇或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1~5mL：0.2~2g；

步骤（1）中震荡酶解时的温度为22~28℃，速度为70~100 r/min，酶解时间为100~160 min。

2.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（2）中过滤用140~180目的尼龙网过滤，清洗采用甘露醇或蔗糖水溶液，其浓度为0.3~0.5 mol/L，离心时离心机的离心力为5×g ~30×g，离心时间为3~10 min，并重复清洗、离心、弃去上清一次。

3.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（2）中所述的水解酶为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为0.8~1.2%w/v，离析酶R-10的浓度为0.2~0.4%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，水解酶用量与原生质体重悬液的体积比为1:10~20。

4.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（3）中所述的亚低温或亚高温条件指：当用于亚低温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度下限减去3~5℃或8~10℃为梯度，获得亚低温温度区间；当用于亚高温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度上限加上2~5℃或8~10℃为梯度，获得亚高温温度区间。

5.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（3）中温浴时间为20~40min，超纯水的加入量为加入水解酶的原生质体总体积的0.5~2倍。

6.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（4）中至少计算90个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值。

7.根据权利要求1或6所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（4）中每个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的计算公式为：Lp=(Vt₂-Vt₁)/[(t₂-t₁)×S×D_osm]，

其中，V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；D_osm为加超纯水稀释前后渗透势的差值；

D_osm由以下公式计算获得：

当渗透调节物质为甘露醇时：Y=1.1736X；

当渗透调节物质为蔗糖时：Y=1.4155X；

其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为酶解液或水解酶中采用的渗透调节物质甘露醇或者蔗糖水溶液的浓度，单位为mM。