[发明专利]一种鲁氏淀粉霉及其发酵生产凝乳酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及凝乳酶的制备方法，具体涉及一种从酒药中提取的鲁氏淀粉霉，以及所述鲁氏淀粉霉发酵生产凝乳酶的方法。

背景技术

凝乳酶是一种天冬氨酸蛋白酶，特异性地水解κ-酪蛋白Phe105-Met106之间的肽键，导致牛奶凝结，广泛用于奶酪与干酪素生产中，传统的凝乳酶来源于小牛皱胃，但随着我国干酪产量的不断增加，小牛皱胃酶供应不足，人们开始不断寻找小牛皱胃酶代用品，而微生物凝乳酶成本较低、酶容易提取、经济效益高，且受限制小，是凝乳酶最有前途的发展方向，因此，在世界范围内，开发微生物凝乳酶替代小牛皱胃酶已经成为乳品科学研究的热点。

微生物凝乳酶与小牛皱胃酶相比仍然存在很多问题，如菌株凝乳活性不高，蛋白水解活性强及耐热性高等，目前微生物凝乳酶的研究主要集中在微小毛霉、米黑毛霉和栗疫霉等真菌，国外已实现规模化生产，而国内大部分凝乳酶主要依赖进口。毛霉属和根毛霉属是研究最为广泛的产凝乳酶种属，刘振民等人研究了酒药中产凝乳酶的微生物，发现根霉可以产凝乳酶，并从中筛选出一株产凝乳酶的菌株，经过优化凝乳活性可达80Su/mL；李子木等人从酒曲中分离得到一株产凝乳酶活性强、蛋白水解活性弱的根霉菌株，通过优化后，凝乳酶活性可达133.3Su/mL，国内外有许多类似的真菌发酵产凝乳酶的研究，但目前，天然菌株筛选的凝乳酶活性都不高，且文献中未见鲁氏淀粉霉(Amylomyces rouxii)发酵生产凝乳酶的研究报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种可以用于制备高活性凝乳酶的鲁氏淀粉霉，并进一步提供所述鲁氏淀粉霉发酵制备高活性凝乳酶的方法。

本发明提供了一种鲁氏淀粉霉菌株，即鲁氏淀粉霉SY-F-01，该菌株分离筛选自酒药。该菌株已于2015年03月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC No.10630；该菌种的分类命名为：鲁氏淀粉霉Amylomyces rouxii。

本发明还提供了一种所述鲁氏淀粉霉发酵制备凝乳酶的方法，具体包括以下步骤：

(1)以蒸馏水为溶剂，分别配制质量百分比8～12％的江米面培养基和质量百分比8～12％的麸皮培养基；将江米面培养基和麸皮培养基以体积比1～3：1～3混合，高温灭菌，即得基础培养基；

(2)在所述基础培养基中加入包含以下成分的辅料：可溶性淀粉18～22g/L，酪蛋白水解物8～12g/L，碳酸钙0.1～0.3g/L；搅拌混合均匀后，高温灭菌，即得发酵培养基；

(3)取浓度为8～12×10⁷个孢子/ml的鲁氏淀粉霉孢子液，以体积比0.4～0.6:100接种于所述发酵培养基中，在25～30℃、150～250r/min条件下摇床培养3～5d，即得发酵液；

(4)将所述发酵液于9000～11000r/min、4℃条件下离心3～7min，收集上清液，即得凝乳酶。

本发明步骤(1)中：所述江米面培养基和麸皮培养基的质量百分比浓度均优选为10％；二者的体积比优选为1：1。

本发明步骤(2)中：所述可溶性淀粉、酪蛋白水解物和碳酸钙均为常规的市售原料，其中，酪蛋白水解物可购自Sigma公司。所述辅料优选包含以下浓度的成分：可溶性淀粉20g/L，酪蛋白水解物10g/L，碳酸钙0.2g/L。所述高温灭菌的条件优选为：121℃，灭菌20min。

本发明步骤(3)中：所述鲁氏淀粉霉孢子液与培养基的体积比优选为0.5:100；所述摇床培养的条件优选为：29℃，200r/min；培养时间优选为4d。在该步骤中，优选使用250mL三角瓶作为培养瓶，培养瓶中培养基的装入量优选为100mL。

本发明步骤(4)中：所述离心的条件优选为：10000r/min、4℃条件下离心5min。

本发明所述鲁氏淀粉霉孢子可采取以下方法获得：将健康的鲁氏淀粉霉菌株在PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上划线活化，28～32℃下培养至培养基上长满孢子；取长有健康孢子的培养基，用无菌水清洗，移入装有适量无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡使孢子散开，用无菌纱布过滤至另一无菌三角瓶中，即得鲁氏淀粉霉孢子的孢子悬液(简称鲁氏淀粉霉孢子液)。所述鲁氏淀粉霉孢子液的浓度优选为8～12×10⁷个孢子/mL，进一步优选为10⁸个孢子/mL。

作为一种优选方案，本发明提供的方法包括以下步骤：