[发明专利]一种口服酵母携带DNA片段作为新型水产口服DNA疫苗的制备方法及应用

说明书

本发明一种由口服酵母携带DNA片段活体靶向水产动物肠道免疫细胞，诱导水产动物产生免疫反应的制备方法。该疫苗生产成本低，使用方法简单，适合大规模生产，而且与传统减毒疫苗相比对动物无毒力威胁。可用在鱼类贝类等水产动物的多种细菌性、病毒性和寄生虫等口服DNA疫苗的开发应用上，使水产动物健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，同时避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

技术领域

本申请涉及一种酵母携带DNA片段的口服DNA疫苗，属于基因工程领域。

背景技术

DNA疫苗是指将病原体抗原基因插入可在真核生物体内表达的质粒中获得重组质粒，将该质粒DNA接种给鱼体后，质粒能够在其体内复制、转录、翻译成相应的抗原蛋白，并以不同的路径和方式刺激鱼体的免疫系统从而产生针对该抗原的免疫应答起到持续的免疫保护作用。

与传统的鱼类疫苗相比，DNA疫苗制备过程简便，且效率较高，具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，因此越来越受到科研工作者的重视。目前鱼类DNA疫苗均采用肌肉注射，但是肌肉注射作为DNA疫苗最为有效的免疫方式耗时耗力，在实际运用中存在一定的局限，不适合在规模化鱼类养殖中推广应用。相比之下，口服免疫安全方便，不受鱼体大小的限制，因此，口服DNA疫苗更具实用优势。目前为止，全世界只有针对鱼感染性造血坏死病毒的DNA疫苗在加拿大获得许可并投入商业化使用，国内被许可的应用于水产的商品化口服DNA疫苗还未见报道。

针对口服疫苗，有效的载体则能够避免保护性抗原在鱼体消化道内被消化而保证疫苗的免疫效果。酵母作为一种食用微生物长期被用于制备食物如面包、馒头，以及啤酒，具有安全性高的特点；酵母的细胞壁含有大量葡聚糖，是一种优质的免疫多糖；酵母具有较强的免疫佐剂效应；重要的是，研究证明酵母对胃肠的分泌物有较强的抵抗能力。因此，酵母是一种理想的口服疫苗的载体。

发明内容

本发明一种由口服酵母携带DNA片段活体靶向水产动物肠道免疫细胞，诱导水产动物产生免疫反应的制备方法。该疫苗生产成本低，使用方法简单，适合大规模生产，而且与传统减毒疫苗相比对动物无毒力威胁。可用在鱼类贝类等水产动物的多种细菌性、病毒性和寄生虫等口服DNA疫苗的开发应用上，使水产动物健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，同时避免目前DNA疫苗所存在的弊端。

鸡卵白蛋白ovalbumin(OVA)是一个很好的模式抗原，经常用于多种免疫研究中。本研究以OVA基因为例，所述重组酵母含有真核基因表达载体pRS426-CMV-OVA，该表达盒在酵母中不表达，但可在哺乳动物细胞中表达。真核基因表达载体可以作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。将该重组酵母混合到鱼饲料中饲喂25g左右红鲫，免疫14天后就能在红鲫血清中检测到特异性抗体的产生，21天抗体达到峰值。本研究证明了口服酵母可以携带DNA片段靶向鱼类免疫细胞引起免疫反应。在此过程中，酵母不仅发挥了呈递抗原的功能，同时还扮演了佐剂的角色。本发明具有应用基因工程酵母作为DNA运送载体，靶向调控水产动物肠道免疫细胞的功能，将本实验所用载体的OVA片段可以替换为多种水产动物病毒或细菌等抗原基因，能够应用于新型口服DNA疫苗开发和生产，实现对水产动物免疫的调节、疾病预防与治疗。

附图说明

图1：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中,泳道M为Trans2K Plus DNAMarker；泳道1,2为CMV和OVA基因片段的PCR扩增产物。

图2：pRS426-CMV-OVA载体的质粒图谱。

图3：pRS426-CMV-OVA，并经SacII/BamHI/XhoI酶切图，其中泳道M为DNA Marker；泳道1为pRS426-CMV-OVA经SacII/BamHI/XhoI酶切的产物