[发明专利]高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片及应用

说明书

技术领域

本发明属生物领域检测装置，涉及一种等距等分进样的用于核酸扩增的高集成度微流控芯片，尤其涉及高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，及其该芯片的应用。

背景技术

癌症、心脑血管疾病、传染病等重大疾病每年夺去我国数以百万计人的性命，疾病诊断之间的个体差异对优质高效的个性化医疗需求越来越大，新的预防、诊断方法研究愈加迫切。疾病的发生一般源于分子变异，实现分子水平早期诊断具有巨大的重要性和紧迫性。因此助力于人类健康维护，发展能够实现疾病预防和早期诊断的个性化医疗检测仪器及相关技术具有重大意义。

在癌症早期突变基因在体内丰度非常低，例如非小细胞肺癌中的L（8）（5）（8）R基因、T（7）90M基因，存在稀有变异和拷贝数变异，应用常规PCR技术检出率很低； 病毒感染潜伏期较长，在早期很难发现。因此核酸分子量化检测显的十分重要。目前常规分子诊断手段荧光定量PCR技术，可实时动态定量观察PCR扩增的变化，但需要与标准曲线比较推算出待检物起始拷贝量，不是绝对测量，仍然无法做到单分子检测。

上世纪九十年代末由Vogeinzler和Klstein发明的数字PCR技术为解决核酸单分子计数检测开辟了道路。数字PCR是通过将样品稀释后通入大量的反应单元中，稀释的倍数满足每个反应单元中所含有的待测分子数不会超过（1）个，再对这些大量的反应单元进行PCR信号扩增放大，并对阳性反应单元逐个进行计数的一种技术。它是一种绝对定量方法，已经被广泛应用于SNP、单碱基突变、拷贝数变异、早期癌症标志物的检测、胎儿无创产前诊断以及单细胞基因表达谱的研究等。

微流控芯片进行数字PCR扩增显示出了巨大的优越性，样品进样、扩增及检测都在封闭体系中实现，减少了孔板数字PCR繁复的加样操作和气溶胶污染。美国Fluidigm公司开发出了商品化的数字PCR芯片，用实时PCR仪进行核酸扩增和定量检测，芯片每个反应小室只需要nL~pL样品，芯片集成度大大改善了数字PCR的检测性能。

许多研究组已开发了数字PCR平台，如微流控芯片、微乳滴、离心式芯片、滑动芯片等，但是这些平台操作复杂，有的需要特殊的仪器，价格昂贵，如微阀控制的微流控芯片需要控制系统；液滴的芯片需要液滴生成器；有的只能单次进样，这就意味着数字PCR上游的样本前处理包括DNA的提取和转录只能在芯片外完成，结果受很大影响；大多数微流控芯片除进样口外还需设计出样口，产生了样品浪费和气溶胶污染；这些都给普通实验室的应用普及带来了困难，更难以作为常规的健康普查手段。自主研发价格低廉、性能优良更加适用于现场医疗检验、疾病防控、食品安全等诸多领域的新型微流控芯片及其检测系统就成了迫在眉睫的任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，是一种用于核酸分子扩增的等距等分进样的高集成度的无动力源无阀型微流控芯片，具有样品分配更加均匀、无需阀门、制作工艺简便、易于操作、多种核酸分子扩增应用的特点。

本发明芯片依次由盖玻片层（1）、反应层（2）、修饰层（3）与封接层（4）由下而上热键合组成，其中反应层（2）设有n（1≤n≤100）个反应模块（8），反应模块（8）利用多层软光刻技术制作出流通通道（5）、反应微腔室（6）和进样口（7）；每个反应模块（8）中的流通通道（5）由多级流通通道组成，其上一级流通通道与下一级流通通道垂直等分；并且每个反应微腔室（6）到进样口（7）的距离相等，可以实现反应液在各级流通通道中更加均匀的分配。

利用制作材料PDMS聚合物本身的透气性质，预先将芯片置于真空泵中，进行抽真空除气处理，然后置于常压环境下，由于流通通道（5）和反应微腔室（6）与外界形成气压差，流通通道（5）和反应微腔室（6）处于负压状态，进样口（7）处的样品溶液利用此气压差自动分配进入各个反应微腔室（6），实现样品的无动力源进样，待反应微腔室（6）均匀充满样品溶液后，向进样口（7）内加入与水不相容的油相液体，同样利用气压差使油相液体吸入流通通道（5）从而将反应样品封入反应微腔室（6）内，实现样品的无阀隔离。整个芯片装置只需从进样口（7）进样，没有出样口，从而实现了无废液进样，既减少了样品浪费又可以避免一些特殊样品例如病毒形成气溶胶污染，更加适用于现场的医疗检验、疾病防控、食品安全等诸多领域。