[发明专利]一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测基因甲基化领域，特别涉及一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法。

背景技术

DNA甲基化是构成表观遗传学的重要组成部分和主要研究内容。通常，甲基化指在CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。在人类DNA中，可被甲基化的CpG二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组某些区域中，通常是基因的启动子区域，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands)。

随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。一般而言，检测DNA甲基化的方法可以分为两类，(1)以亚硫酸氢盐修饰的DNA为基础并在此基础上发展出来的各种方法。(2)以甲基化敏感限制性内切酶消化为基础的研究方法。第一种方法研究的很多，能够达到定性以及定量的检测甲基化水平。常用的有甲基化特异性的PCR(MS-PCR)，定量甲基化特异性的PCR(qMS-PCR)，高分辨熔解曲线分析(MS-HRM)，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法(Ms-SNuPE)，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)，荧光定量法(MethyLight)等。这些方法都会经过亚硫酸氢盐处理这一步，从而实现定量检测DNA甲基化。然而，这些方法有着不可避免的劣势，比如高费用，操作费时费力，专业的仪器和专业的操作，掺入放射性元素等。焦磷酸测序是一种实时的，低消费，高通量的定量检测甲基化的方法，但由于酶的不稳定性导致检测的DNA片段长度受限。

以甲基化敏感限制性内切酶消化为基础的研究方法需要DNA样本在进行PCR扩增之前进行限制性内切酶酶切操作。甲基化敏感限制性内切酶能够识别特定的位点区域，对非甲基化部分可以切割，然而对甲基化部分无法切割，通过对扩增片段的比较，从而能够区分甲基化和非甲基化位点，明确甲基化状态。这种方法操作简单，消费较低，并能灵敏的检测甲基化，然而存在很难进行定量分析的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法，该方法操作简便，费用低廉，灵敏度高，可以实现高通量的定性及定量检测甲基化水平，有着较强的通用性，有很好的应用前景。

本发明的一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法，包括：

(1)取三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构量子点QDs稀释于正己烷溶液；在超声条件下，逐滴加入巯基乙胺Cys溶液；超声后，量子点转入水层，弃去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli–Q超纯水中，制备得到Cys包裹的水溶性CdSe/CdS/ZnS QDs量子点；

(2)分离提取DNA，检测浓度；取基因DNA样本，加入HpaII甲基化敏感限制性内切酶、NEBuffer和超纯水，作为实验组；再取基因DNA样本与NEBuffer和超纯水混合，作为对照组；两组DNA样本37～38℃过夜处理，加热使酶失活；

(3)针对PCDHGB6、HOXA9和RASSF1A基因设计引物，序列至少包含2个CCGG；

(4)将步骤(2)中的两组DNA样本经过PCR扩增引入量子点荧光共振能量转移FRET中能量受体Alexa Fluor-647(A647)，取部分PCR产物用于凝胶电泳成像；剩余PCR产物加入SAP酶和SAP缓冲液，经过35～40℃处理1～2h，加热使酶失活；SAP处理后，取步骤(1)中的量子点溶于HEPES缓冲液进行稀释，然后取SAP处理的PCR产物与稀释后的量子点混合，置于96孔板中孵育，使用荧光光谱仪检测FRET，计算甲基化程度。

所述步骤(1)中的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构量子点QDs稀释于正己烷溶液后的浓度为10^-6M；巯基乙胺Cys溶液的浓度为20mg/mL。

所述步骤(2)中的基因DNA样本与HpaII的比例为10ng:1U；与NEBuffer的比例为100ng:1μL。

所述步骤(2)中的加热温度为85℃，加热时间为15min。