[发明专利]重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因工程与动物病毒学技术领域，特别涉及重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种严重危害猪群的病毒病。主要特征表现母猪繁殖障碍及育肥猪和小猪呼吸困难。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能够诱导中和抗体产生及免疫保护。因此作为研究对抗PRRS的基因工程疫苗的主要靶位点。虽然灭活和修饰后的活疫苗可以利用，但是其保护性不再完整。因此为了研究对抗PRRSV感染的有效疫苗，须发展一种新的技术。

作为RNA病毒，PRRSV的基因在合成时容易出现内在性错误，灭活疫苗诱导细胞免疫的能力较弱，产生的保护作用较短，蓝耳病还存在“抗体依赖性增强作用”。因此用于发展预防PRRS的灭活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的弊端。基于此，利用基因工程方法研制PRRSV的亚单位疫苗具有更好的免疫原性，将成为防治该病的重要方向。因此，该亚单位疫苗在猪蓝耳病的防制方面将具有很广泛的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明提供重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。该重组病毒毒株高效表达猪蓝耳病病毒GP5蛋白，使其具有更好的免疫原性，并且制得了免疫效果好的亚单位疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组质粒，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与质粒载体重组构建而成。

根据PRRSVGP5基因序列，利用PCR扩增结合DNA拼接、克隆的方法(参见：J.萨姆布鲁克等，王嘉等译.分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年版)对ORF基因进行修饰，通过PCR方法去除GP5基因其N端信号肽的31个氨基酸。将GP5基因插入到杆状病毒表达载体中，构建重组表达质粒。引物A1(如SEQIDNo.5所示核苷酸序列)、A2(如SEQIDNo.6所示核苷酸序列)用于扩增GP64编码的序列；引物B1(如SEQIDNo.7所示核苷酸序列)、B2(如SEQIDNo.8所示核苷酸序列)用于扩增GP64TM-CTD编码的序列；引物C1(如SEQIDNo.2所示核苷酸序列)、C2(如SEQIDNo.3所示核苷酸序列)用于扩增PRRSV-ORF5基因，获得目的片段。

在本发明的一些具体实施方案中，重组质粒中所述PRRSVGP5基因片段的扩增引物组由如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明还提供了一种重组病毒载体，其由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与病毒载体重组构建而成。

在本发明的一些具体实施方案中，重组病毒载体中所述PRRSVGP5基因片段的扩增引物组由如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明的一些具体实施方案中，重组病毒载体中所述病毒载体为昆虫杆状病毒表达质粒载体。

在本发明中，构建了一种新型的pBacSC载体。编码gp64SS，HIS6的序列、多克隆位点(BssHII，NcoI位，NHE位和SphI位)集中在HIS6与杆状病毒gp64CTD之间，杆状病毒细胞进入是通过gp64蛋白介导，在宿主细胞表达后，gp64蛋白SS直接穿过细胞膜，并以三聚体的形式出现于受感染细胞表面，该融合蛋白的表达与本体的糖蛋白gp64启动后，转入质膜，进入杆状病毒包膜内。以假型杆状病毒作为一个潜在的疫苗传递系统的方法已被广泛使用。

本发明还提供了一种重组病毒毒株，由本发明提供的上述重组病毒载体经包装细胞包装而成。

本发明首先扩增PRRSV-ORF5基因，获得507bp目的基因片段(如SEQIDNo.1所示核苷酸序列)，将其与昆虫杆状病毒表达载体质粒连接，通过酶切反应鉴定及序列分析得到重组表达质粒；测序表明，扩增得到507bp的PRRSV-ORF5基因，与已发表的PCV2序列同源性达到97％以上，表明该基因具有很高的保守性。将所得到的重组表达质粒与线性化杆状病毒DNA共浴，加入细胞转染试剂，取转感细胞培养上清做蚀斑克隆与筛选试验，采用病毒培养物上清，接种昆虫细胞，筛选获得一株稳定、高效表达PRRSV-GP5蛋白的重组杆状病毒毒株(BacSC-Dual-GP5)。

本发明提供的病毒株的生物保藏编号为CGMCCNo.2467或CGMCCNo.2657。