[发明专利]天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用

说明书

本发明提供了一种天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用。通过对雪莲细胞的转录组测序，并对测序结果进行分析和筛选得到SiPAL基因。该基因的cDNA长度为2405bp，开放读码框位于120‑2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用该基因与植物表达载体相连接得到的SiPAL重组表达载体，制备得到该酶，可以应用于以L‑苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明可以通过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，尤其是在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养领域。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶(SiPAL)基因及其编码产物和应用。

背景技术

天山雪莲(Saussurea involucrata)系菊科风毛菊属植物，主产于新疆天山、昆仑山，生长在雪线以上，民间以全草入药，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效，用于治疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳痿等疾患^[1]。由于天山雪莲生长环境特异、人工栽培困难，雪莲细胞成为天山雪莲的替代品之一。雪莲细胞中主要含有紫丁香苷等木质素类成分^[2-4]，其生物合成途径的第一个关键酶就是苯丙氨酸解氨酶。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanin ammonia-lyase，PAL)为催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，是这个途径的关键酶和限速酶，它在木质素、香豆素、类黄酮、黄酮醇、异黄酮和花青素等次生代谢产物合成中起重要作用。它的功能是催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为紫丁香苷等木质素。天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶(SiPAL)基因的克隆，为利用基因工程提高雪莲细胞活性成分紫丁香苷含量提供重要基础。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明中所提及的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。

参考文献：

[1]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》2010年版(一部).北京:化学工业出版社,2010:50-51.

[2]李君山,蔡少青.雪莲花类药材的化学和药理研究进展[J].中国药学杂志,1998,33(8):449-452

[3]李燕,郭顺星,王春兰,等.天山雪莲细胞培养物化学成分研究[J].中国药学杂志,2008,42(23):1768-1769.

[4]陈日道.天山雪莲培养物的化学成分及紫丁香苷含量研究[D].沈阳:沈阳药科大学,2009.

发明内容

本发明为解决现有技术中存在的上述问题，提供由天山雪莲(Saussureainvolucrata)细胞中克隆的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶(SiPAL)基因，该基因cDNA的长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一方面在于公开上文所述的SiPAL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的扩增引物，其序列如SEQ IDNO：3～4所示。

本发明的另一方面在于公开含有上文所述SiPAL基因重组表达载体。本发明所提供的SiPAL基因，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到SiPAL基因重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒pET-31b(+)。本发明的SiPAL基因在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。