[发明专利]一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

氟喹诺酮类药物如氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星等，对大肠杆菌、沙门杆菌、葡萄球菌、克霉白杆菌、志贺杆菌、变形杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌等抗菌活性较强，对化脓杆菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体也有良好的抗菌作用。氧氟沙星药物的作用机理同其他喹诺酮类抗生素一样，通过抑制细菌的DNA旋转酶（gyrase）的合成，阻断DNA的正常的合成与复制，导致细菌死亡。因此，喹诺酮药物是目前人兽共用的抗感染的主要药物之一。但是当动物体内喹诺酮类抗生素长期积累达到某个程度时，生物体内对此类抗生素的耐药性增强，耐药细菌的数量逐渐增加，最后导致此类药物的药效降低；除此之外，还会损伤幼龄动物的软骨生长。大剂量的此类抗生素进入人体，会导致胃肠道不适，中枢神经和肝细胞受损等不良反应。氧氟沙星属于氟喹诺酮类药物，因其8-位被氟元素取代增强了光毒性，长期食用兽药超标的动物源食品不仅对人体健康造成直接或间接的伤害，还会造成人体对此类药物产生抗药性，不利于细菌性疾病的预防和治疗。因此，很多国家和地区均规定了此类抗生素在动物源食品中的最大残留限量。

美国食品药品监督管理局（FDA）就明令禁止喹诺酮类药物用于食源性动物的细菌感染治疗上，我国严格规定了动物源食品中喹诺酮类药物的残留量，最高残留限量为0.01~1.9mg·kg^-1，日本规定进口的鳗鱼及鳗鱼产品的残留检测限量应在0.05mg·kg^-1以内。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中喹诺酮类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发是十分有必要的。基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，因此筛选氧氟沙星的特异性适配体对于建立高效快速、特异灵敏的氧氟沙星检测方法具有十分重要的意义。

指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，简称为SELEX）是由Tuerk和Gold于1990年开发的一种体外筛选技术，认为该技术经过发展可以得到蛋白质的高亲和配基。该技术是新建立的一种体外合成的组合化学技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有10¹³~10¹⁵个不同基元的初始文库中，经过几轮或数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。核酸适配体的筛选技术可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

本发明通过氧化石墨烯-SELEX（GO-SELEX）技术，利用氧化石墨烯可以富集ssDNA分子，而不富集与氧氟沙星结合的ssDNA，以氧化石墨烯作为筛选中结合与分离的介质，通过多轮筛选得到可以与氧氟沙星高特异性结合的ssDNA适配体序列，为氧氟沙星尤其是食品中氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。

发明内容

本发明的目的是通过改良的GO-SELEX技术，借助于氧化石墨烯可以结合ssDNA分子，而不能结合与氧氟沙星结合的ssDNA分子的特点，以其作为结合与分离的介质，筛选得到能特异性结合氧氟沙星的ssDNA适配体。该适配体是氧氟沙星的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

本发明的技术方案：

特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体，选自序列表A1~A12所示序列的一种或多种，包括含有A1~A12所述序列的ssDNA。