[发明专利]玉米非生物胁迫响应因子ZmERF1基因启动子序列及其应用

权利要求书

1.玉米非生物胁迫响应因子ZmERF1基因启动子，其特征在于：响应因子ZmERF1基因启动子全长序列2217bp：

ATTTAAGCTT GAAGTTGATG GCATCAATCT GCCAGTCTGA TTTTCAGACC TATCCAACCT

GACAGCCTGA CTTTAGGCAT GATTATCTCT AAATTTTTCA CAAGAACATG GCTTGCACTC

TTAAGCAAAT TTGTTATCCA TTGATTGCTC TACAATTTTG ATGTGGTGAC TTAGGGCAAA

AACCCTATGC TTTACAAGTT ACAAAGCCCT AAAGTGGAGC CTTTAACACT GAATTTCAGA

CTTAGTGTAG AACTCAAATG AGGTCCATTT TGCATTTAAG TCCAAAACTT AGGGTTTGGC

TTTCAAGTCC ACATATTTGT GAACCAAAGG ACTTAAAATA CTTATTTGGC TTGGTTTTTG

CACTTTAGTC CAAAAGTGGA CCAATTTTGC ATATAAACCC CTAGGGTTTG GTTTCAGGGT

TTTCCAGGGT TTTAATTAGG GTTTCTGGTA TCCCAGGGGT ACAAAAGTGA TTCAAGTTTA

TTCTTAGGGT CATTTTATGA CTTTTACCCT AAAGCTTTTA GATTTTCTCA ACTTGGGTTA

AGTTTTACCC CTTTAACCAC TATTTAGGGT TAAGTCCTTT AACCAGGGTT CTTTTTGCAA

AACAACACAA CTTGTTTGAA ATTTTTGCCT AGTGAATGCA CTCTAGGTGT GTCAAACATA

TGCAATGCCA ATGCTATGAT GCCATGCTCA AGTTTTAGTT ACAGTAACAC CAGGGGTGTT

ACAATTGCTG TGGATGACGC TCAAATCCAT TGGGTCGTCT AGGCTTGAGT TGATCCAATC

CTGCGTCGAT CCACTTCGCT AGACGTTCCT CCCCAGGCCC ACAAAGGGAT GACCTTGCGA

AATATTGGGC CCAAAGCCTT TCGCGAGGTC TTCTAACCTT CCAGTGGACC TGGGGGATAT

CTGTCCCCCA CACATTATGC CCGAAGGGAG ATAATGCTTC GAAGGACAAA GGTCTTTAAC

ACTTAAGAAT TTTGTTGCGT TGTTTCATGA TTAAGTAATA AAAACAAGAG ATCAACACTA

TGCTCTTTTC TTAATCGATC ATTCTAAAAA GTACATGATT TTTGTCGACT TTACACCCAC

TCAAAATTGG TGTAAGCACA TGCCATACAA GAGGTTCATA GAAACGATTA TCATGGCCTT

AAAGAAATAT AAGATTGTCT ACAGCATGAA ACGTTCTAGA TGGGTGGTGG ATATTTTTAA

ATTGGAAAAT AAAATTCAGA CTGATGCTTC AATTGACATA AAATGATATT TTCTCCGTGC

CACCTTCTCA GCAATTTAAT TTTTTCTATG ATTTCCATTA CATATAACAT AGTTGGCAAA

ACATTATTAT GAAGGATTAA CACCAGCTAC CTCGTTCTAC AAGCTATGTC CATGGGGGTA

ATAACAGGCG AATGGAATTT GTTAGGGGTG AGTGGAGTAC GCATGTTTCA CGTTCAAGTA

TACATTAATA AAAACATTGG TATTTTGTTC ACTTATGTCT TTGTGTGTAG GATGTATATA

TTCTTCCAAG AAACTTTATG ATCGATCTGT TAATTTATGA GGACAATTCG TGCCGATATG

TCATCCCTCC AAACATACAG CATAGACTTA TCAATATCGC TAAAGAGGAT TAAATTAGTG

ACGGTTGTCG ACATATTCGT CTATCATTAA AAATTCTATA TTGACTATTT AGAAATAAT

TTGTATGATA TTGATAATGT TCGATATTAT TTCAATCTAT TTTAGTCAGC GTATTTATAA

TAATTATATA TTTATATCAT CAATATAATA TTATTGTTAT GATAATATTT TATAGTACGA

ATTTTATATA TTATGAAATA TCGTTTCATA TATATGTTTT ATATTAATTT TTCTAATTTA

CTTAAGCATC TGACGCTAAG TGTCCTGTGC CCGGATCGGC CAGAGCGGTC AAATGGTTCA

ATGCTTTACC TCCTCTGGTT GGTGTCCAGC TTGGGGGCAG CTGCCTTTCA TTTCCATTCT

TCCAGTTGCA CCCAGACCCA GGCAGGTCAT CGGCGCCCAC AACTCCAAGT TGTATAAATA

CTCCGTCGAC CGTCTCATAA CAGTCATACC GCCGAACCAA ATCCAACGTC CACAGAAAAG

AAAACACATT CCCGTCGACT CCCCTAGTTT CATCCTATTC ATTTCTCCCC CCAAACACTC

CAGCTACTAG TTACTCGAGG AATCCATGTG CGGCGGCGCA ATCATCTTCG ACTACAT；

玉米自交系N04 ZmERF1基因启动子的克隆及序列分析如下：

a. 玉米自交系N04 DNA的提取

取0.5 g幼嫩叶片置于研钵中，加入液氮后研磨成粉末，将粉末迅速装入2.0 mL的离心管中，加入800 μL质量分数1% SLS提取液，加入800 μL 按照比例为25：24：1的苯酚、氯仿与异戊醇组成的混合液，充分混匀，65℃温育30 min，冷却至室温后，12000 rpm离心10 min，吸取上清液转至另一干净的1.5 mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的预冷异丙醇混匀，12000 rpm离心10 min，弃上清液，用75%乙醇漂洗，漂洗后短暂离心，留DNA于管底进行干燥，DNA干燥后用灭菌水溶解，置于-20℃冷藏备用；其中质量分数1% SLS提取液是将100 mmol.L^-1 Tris-HCl、100 mmol.L^-1 NaCl、20 mmol.L^-1 EDTA和10 g_.L^-1 SLS混匀，然后调节PH=8.0后获得的混合液；

b. ZmERF1基因启动子的克隆

根据玉米自交系N04 ZmERF1基因的启动子序列，设计了两对特异性引物，这两对引物扩增的片段相重叠，特异性引物序列I为：F1391：5'GCGGATCCATTTAAGCTTGAAGTTGATGGC3'和R1391：5'TATTACCCCCATGGACATAGCT3'；特异性引物序列II：F865：5'AAGCTATGTCCATGGGGGTAAT3'和R865：5'GCAGATCTATGTAGTCGAAGATGATTGCGC3'；以玉米自交系N04的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为：5 μL Hifi Buffer (10×)，2 μL 2.5 mol.L^-1 dNTP，1 μL Primer-F (R)，1 μL Taq DNA Polymerase，1 μL 模板DNA，ddH₂O补足50 μL；PCR体系扩增程序为：95℃预变性4 min，95℃变性45 sec，60℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，共循环34次；72℃延伸10min，10℃ forever；扩增产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收，并且连接到PMD18-T载体上，进行测序；

测序的启动子序列为：

PMD18-1391：

GCGGATCCAT TTAAGCTTGA AGTTGATGGC ATCAATCTGC CAGTCTGATT TTCAGACCTA

TCCAACCTGA CAGCCTGACT TTAGGCATGA TTATCTCTAA ATTTTTCACA AGAACATGGC

TTGCACTCTT AAGCAAATTT GTTATCCATT GATTGCTCTA CAATTTTGAT GTGGTGACTT

AGGGCAAAAA CCCTATGCTT TACAAGTTAC AAAGCCCTAA AGTGGAGCCT TTAACACTGA

ATTTCAGACT TAGTGTAGAA CTCAAATGAG GTCCATTTTG CATTTAAGTC CAAAACTTAG

GGTTTGGCTT TCAAGTCCAC ATATTTGTGA ACCAAAGGAC TTAAAATACT TATTTGGCTT

GGTTTTTGCA CCTTAGTCCA AAAGTGGACC AATTTTGCAT ATAAACCCCT AGGGTTTGGT

TTCAGGGTTT TCCAGGGTTT TAATTAGGGT TTCTGGTATC CCAGGGGTAC AAAAGTGATT

CAAGTTTATT CTTAGGGTCA TTTTATGACT TTTACCCTAA AGCTTTTAGA TTTTCTCAAC

TTGGGTTAAG TTTTACCCCT TTAACCACTA TTTAGGGTTA AGTCCTTTAA CCAGGGTTCT

TTTTGCAAAA CAACACAACT TGTTTGAAAT TTTTGCCTTG TGAATGCACT CTAGGTGTGT

CAAACATATG CAATGCCAAT GCTATGATGC CATGCTCAAG TTTTAGTTAC AGTAACACCA

GGGGTGTTAC AATTGCTGTG GATGACGCTC AAATCCATTG GGTCGTCTGG GCTTGAGTTG

ATCCAATCCT GCGTCGATCC ACTTCGCTAG ACGTTCCTCC CCAGGCCCAC AAAGGGATGA

CCTTGCGAAA TATTGGGCCC AAAGCCTTTC GCGAGGTCTT CTAACCTTCC AGTGGACCTG

GGGGATATCT GTCCCCCACA CATTATGCCC GAAGGGAGAT AATGCTTCGA AGGACAAAGG

TCTTTAACAC TTAAGAATTT TGTTGCGTTG TTTCATGATT AAGTAATAAA AACAAGAGAT

CAACACTATG CTCTTTTCTT AATCGATCAT TCTAAAAAGT ACATGATTTT TGTCGACTTT

ACACCCACTC AAAATTGGTG TAAGCACATG CCATACAAGA GGTTCATAGA AACGATTATC

ATGGCCTTAA AGAAATATAA GATTGTCTAC AGCATGAAAC GTTCTAGATG GGTGGTGGAT

ATTTTTAAAT TGGAAAATAA AATTCAGACT GATGCTTCAA TTGACATAAA ATGATATTTT

CTCCGTGCCA CCTTCTCAGC AATTTAATTT TTTCTATGAT TTCCATTACA TATAACATAG

TTGGCAAAAC ATTATTATGA AGGATTAACA CCAGCTACCT CGTTCTACAA GCTATGTCCA

TGGGGGTAAT A

PMD18-865：

AAGCTATGTC CATGGGGGTA ATAACAGGCG AATGGAATTT GTTAGGGGTG AGTGGAGTAC

GCATGTTTCA CGTTCAAGTA TACATTAATA AAAACATTGG TATTTTGTTC ACTTATGTCT

TTGTGTGTAG GATGTATATA TTCTTCCAAG AAACTTTATG ATCGATCTGT TAATTTATGA

GGACAATTCG TGCCGATATG TCATCCCTCC AAACATACAG CATAGACTTA TCAATATCGC

TAAAGAGGAT TAAATTAGTG TACGGTTGTC GACATATTCG TCTATCATTA AAAATTCTAT

ATTGACTATT TAGAAATAAT TTGTATGATA TTGATAATGT TCGATATTAT TTCAATCTAT

TTTAGTCAGC GTATTTATAA TAATTATATA TTTATATCAT CAATATAATA TTATTGTTAT

GATAATATTT TATAGTACGA ATTTTATATA TTATGAAATA TCGTTTCATA TATATGTTTT

ATATTAATTT TTCTAATTTA CTTAAGCATC TGACGCTAAG TGTCCTGTGC CCGGATCGGC

CAGAGCGGTC AAATGGTTCA ATGCTTTACC TCCTCTGGTT GGTGTCCAGC TTGGGGGCAG

CTGCCTTTCA TTTCCATTCT TCCAGTTGCA CCCAGACCCA GGCAGGTCAT CGGCGCCCAC

AACTCCAAGT TGTATAAATA CTCCGTCGAC CGTCTCATAA CAGTCATACC GCCGAACCAA

ATCCAACGTC CACAGAAAAG AAAACACATT CCCGTCGACT CCCCTAGTTT CATCCTATTC

ATTTCTCCCC CCAAACACTC CAGCTACTAG TTACTCGAGG AATCCATGTG CGGCGGCGCA

ATCATCTTCG ACTACATAGA TCTCG；

c. 转化载体的构建

用BamHI和NcoI双酶切连接在T载体上的1391 bp启动子序列，同时用BamHI和NcoI双酶切pCAMBIA1301载体；回收后将pCAMBIA1301载体与1391 bp启动子序列连接；然后转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆摇菌，PCR检测正确的单克隆提取质粒，酶切鉴定；鉴定正确携带有1391 bp启动子序列的pCAMBIA1301载体再用NcoI和BglII双酶切，同时用NcoI和BglII双酶切连接在T载体上的865 bp启动子序列；回收后将携带有1391 bp启动子序列的pCAMBIA1301载体与865 bp启动子序列连接；然后转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆摇菌PCR检测正确的单克隆提质粒，酶切鉴定，获得ZmERF1基因启动子全长序列2217bp;

d. 玉米自交系N04 ZmERF1基因启动子序列分析

将克隆得到的ZmERF1基因启动子序列进行顺式元件的预测分析，结果显示该启动子除具有植物启动子的典型特征外，还含有乙烯响应相关的元件2个以及ABA激素应答ABRE元件1个；脱水相关MYB1AT元件4个、MYCATERD元件1个和MYCATRD元件1个；低温抗寒调控元件18个、CBFHV元件8个；伤害调控WBOXNTERF元件9个；热休克CCAATBOX元件1个；组织特异性表达调控CAATBOX元件27个；种子发育相关EBOXBNNAPA元件18个；淀粉酶相关AMYBOX2元件1个、CGACGOSAMY元件1个；糖相关WBOXHVISO元件5个；调控根毛发育相关RHERPATEXPA元件2个。

2.根据权利要求1所述玉米非生物胁迫响应因子ZmERF1基因启动子的应用，其特征在于：将ZmERF1基因启动子序列克隆至表达载体，转化植株的根部、叶或花序部位进行盐胁迫、渗透胁迫处理，随后进行化学组织染色和GUS荧光定量分析ZmERF1基因启动子对逆境的反应。