[发明专利]人用布氏菌弱毒疫苗株104M的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称“布病”)是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病。人感染布病后，急性期表现为间歇热、乏力、多汗、肌肉和骨关节疼痛及神经痛等；部分患者会转化为慢性布病，症状为惯性疲劳、抑郁，体重减轻和反应性关节炎，反复发作，且可终身带病。近年我国人间和畜间布病发病率都有不同程度回升，严重威胁人类健康和畜牧业发展。

弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，我国人用疫苗为布氏菌弱毒疫苗株104M。该疫苗于1965年开始应用，是目前我国唯一的人用布病疫苗，其使用对象主要是屠宰、放牧、皮毛加工等重点职业人群，研究显示通过免疫可有效降低布病发病率。但弱毒疫苗的使用可对布病的诊断和监测造成干扰。因此，实现弱毒疫苗与野生菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要现实意义。

弱毒疫苗株的鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。104M为光滑型菌株，其LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行，且难以区分104M与同生物型的其它菌株，限制其广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，引物信息如下：

Dsba-F:GGACATAACGAACATTCGGATCT(SEQ ID NO:1)

Dsba-R:TCGATTACAATTGCGGCTATTG(SEQ ID NO:2)

Dsba-P:ATCGCTTCCATGTCG(SEQ ID NO:3)

其中Dsba-P的5′端用FAM进行标记；3′端用MGB进行标记。

本发明还提供一种利用上述的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组检测104M株的方法，包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；

2)Taqman-MGB荧光定量PCR步骤：根据本发明设计104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组，加入反应体系中各组分。反应程序：95℃ 3min；95℃ 5s，56℃ 10s，72℃ 10s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。

另一方面，本发明的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组可用于制备检测试剂盒。

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10^-4ng/μl；2)特异性强：采用MGB标记的荧光探针，特异性针对104M基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Taqman-MGB荧光定量PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。

附图说明

图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即104M基因组的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。

图2：Taqman-MGB荧光定量PCR方法检测104M基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1-8.104M基因组DNA的质量浓度分别为1ng/μl，1.0×10^-1ng/μl，1.0×10^-2ng/μl，1.0×10^-3ng/μl，1.0×10^-4ng/μl，1.0×10^-5ng/μl，1.0×10^-6ng/μl；曲线8.阴性对照。