[发明专利]一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用，属于微生物基因工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一种能将腈类物质水合成更有价值的酰胺类化合物的金属酶。NHase在微生物中分布比较广泛，目前已经在红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、丛毛单胞菌属(Comamonas)中都可以得到腈水合酶的基因序列。红球菌Rhodococcus rhodochrous J1作为第三代生产菌株已经广泛用于丙烯酰胺的工业生产。通过此方法生产的丙烯酰胺年产量近百万吨，将近总产量的三分之一。红球菌中主要用于转化生成丙烯酰胺的是含有的腈水合酶。经过诱导可产生两种物理化学性质以及底物特异性不同的腈水合酶：低分子量腈水合酶L-NHase和高分子量腈水合酶H-NHase。两者均由β亚基、α亚基构成，β亚基基因位于α亚基基因的上游。两种腈水合酶同源性为58.1％。

而本发明中的高分子量型腈水合酶H-NHase与低分子量型腈水合酶L-NHase相比更稳定，产物耐受性更好，目前工业上主要是通过诱导J1菌中H-NHase的表达，并以此来大量生产丙烯酰胺。但是野生菌中合成的NHase稳定性差，且红球菌Rhodococcus rhodochrous J1培养时间长(90h左右)，立体选择性弱，且表达量低。不利于大规模制备，并且对菌种的重复使用次数有很大限制。

由于一些放线菌来源的腈水合酶基因在以大肠杆菌为宿主的体系中表达时，所受到的调控机制与野生菌区别较大，表达出来的蛋白极易聚集形成包涵体，因而放线菌来源的腈水合酶基因的异源表达在过去10多年中研究进展缓慢。Co-NHase的异源表达存在酶活力低，SDS-PAGE无法检测到目标表达条带，调控蛋白稳定性差，半衰期短，易降解等难题(Zhou Z，Hashimoto Y,Shiraki K,et al.Discovery of posttranslational maturation by self-subunit swapping.Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(39):14849-14854.)

大肠杆菌的密码子使用具有简并性，即一个氨基酸由两个以上的密码子编码。但是，大肠杆菌并不是同等地使用每个密码子来编码氨基酸的，对某一个氨基酸而言，大肠杆菌通常倾向于更多地使用它所对应的同义密码子中的一种或数中，而不是均衡地或随机地使用每一种同义密码子来编码它，及大肠杆菌的密码子使用具有偏好性。分析之前Kobayashi等人直接将高分子量型腈水合酶基因在大肠杆菌异源表达没有获得高表达量的原因，并考虑到大肠杆菌密码子偏好性的因素，本发明将原始高分子量腈水合酶基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行同义突变，从而通过提高蛋白翻译速度和翻译精度以提高异源表达蛋白的量(Bulmer M.The selection-mutation-drift-theory of synonymous codon usage.Genetics,1991,129:897-907)。