[发明专利]环境水体致TK6细胞染色体损伤遗传毒性检测技术及应用

说明书

本发明提供一种环境水体致TK6细胞染色体损伤遗传毒性检测技术及应用，属于环境科学和健康风险评价领域。所述方法包括环境水体样品的前处理过程、细胞培养及染毒方法、微核制片流程和结果分析方法等。本发明所提供的微核实验方法可直接用于监测环境水体遗传毒性，为水污染健康风险管理提供重要的遗传毒性效应信息。

技术领域

本发明涉及一种环境水体致TK6细胞染色体损伤遗传毒性高通量快速检测方法，属于环境科学和健康风险评价领域，是检测水环境样品遗传毒性的实验方法，具体来说是利用TK6淋巴细胞微核实验检测环境水体致真核细胞染色体损伤遗传毒性大小的检测技术及其应用。

背景技术

环境水体综合遗传毒性监测在环境健康综合监测中具有重要作用，可以明确环境污染对人群健康的危害。环境监测往往关注理化指标的检测，如COD等综合性指标和重金属等具体污染物含量，继而判断环境污染状况，但受污染的环境对暴露人群的健康究竟能够产生多大的危害作用却并不明确。即使各污染物含量符合国家标准，但其在共同暴露条件下可能发生复合毒性作用，因此有必要对环境样品对生物体的毒性进行测定。遗传毒性是指环境中的理化因素作用于有机体，使其遗传物质受到损伤而造成的毒性作用。遗传物质的损伤往往与癌症等多种疾病的发生密切相关，因此检测环境样品的遗传毒性可以预测其对生物体的毒性大小。

现有遗传毒性检测方法有待进一步完善以适用于水体综合遗传毒性监测。遗传毒性的检测方法根据机理的不同分为多种，其中以检测染色体损伤为检测终点的实验可以反应出受试物对染色体、DNA等遗传物质的损伤作用。检测方法包括单细胞凝胶电泳技术、染色体畸变试验和微核实验等。其中单细胞凝胶电泳技术是反应受试物致DNA断裂作用的实验方法，实验操作步骤较为复杂，不适用于大规模样品的监测；染色体畸变实验是检测化学物质影响染色体组数量和结构的基本方法，虽然实验操作较为简单，但原则上只适合超倍体的观察，因此应用有限；微核实验是检测染色体损伤的实验方法，可以检测染色体断裂和染色体加倍。微核来源于有丝分裂过程中无着丝粒染色体片段(也就是缺少着丝粒)，或者是无法在细胞分裂后期迁移至两极的整条染色体(纺锤体受损)，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。微核实验操作较为简单，结果准确率高，比较适用于大规模样品遗传毒性监测。但传统的微核实验多以人外周血淋巴细胞为受试细胞，要求采集健康、成年人的外周血，采集人群要求年龄低于35周岁、无吸烟、喝酒等因素的干扰，对受试细胞的来源要求较为严格，否则可能造成假阳性结果；另外血样采集后需立即进行培养、染毒等处理，每次试验前都需现场采集血样，另外人外周血淋巴细胞微核实验所需样品量较大，且每次采集的血样质量间存在差异，这使得微核试验在环境监测中的广泛应用受到制约。

以TK6人成淋巴细胞为受试载体的微核实验可以满足环境水体遗传毒性监测需求。为使微核实验能满足上述需求，需要一个稳定的、灵敏的、具有代表性的细胞系来替代人外周血进行微核实验。TK6人成淋巴细胞是稳定构建的细胞系，其来源是人类淋巴母细胞，能稳定进行细胞传代培养，TK6细胞在微核实验中已有较为广泛的应用，结果显示其结果稳定、灵敏度高，但用于环境水体遗传毒性检测的具体实验方案有待建立和完善。

发明内容

为解决现有微核实验在环境样品遗传毒性中的应用限制，本发明对微核实验进行了一定程度的改进，通过使用TK6人成淋巴细胞系代替人外周血淋巴细胞，简化了实验操作步骤、降低受试水体的用量，实现了高通量快速检测；同时使用稳定的细胞系可以保证结果更加稳定、准确，避免了使用人外周血淋巴细胞时不同细胞来源之间的差异。本发明以TK6人成淋巴细胞为受试细胞，用于检测环境水体样品的致染色体损伤遗传毒性大小，内容包括环境水体样品的前处理、TK6细胞培养、细胞染毒、微核制片、微核计数以及结果分析等实验过程。

1水样前处理

(1)环境水体样品采集之后首先经过0.45μm玻璃纤维滤膜过滤、HLB固相萃取柱富集以及丙酮洗脱、合并，以及干燥等具体前处理步骤；

(2)实验试剂配制；