[发明专利]在大肠杆菌中表达胶原酶的DNA分子、重组胶原酶的方法及应用

权利要求书

1.一种胶原酶蛋白质分子，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。

5.一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，其特征是，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入权利要求3或4所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述重组大肠杆菌是将权利要求2所述的DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCC No.10684。

6.一种纯化重组胶原酶的方法，其特征是，按照下述步骤进行：

(1)培养上述权利要求5得到的的重组大肠杆菌，直至OD_600nm为0.6-0.8之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,在22℃条件下振荡诱导培养16h；

(2)室温下收集大肠杆菌菌体，用超声破碎的方法将菌体破碎，将破碎后的裂解液离心，离心后对含有可溶性重组胶原酶的上清组分过滤除菌，得到无菌上清重组胶原酶液；

(3)将步骤(2)中所述的无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱，挂柱条件为：①用5倍柱体积超纯水以1mL/min的流速洗柱；②5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速过柱；③以0.1mL/min的流速将10mL柱体积无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱；④用5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱；⑤用缓冲液2洗涤蛋白纯化柱，监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白既得重组胶原酶；其中，缓冲液1的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及20mmol/L咪唑；缓冲液2的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及250mmol/L咪唑。

7.一种重组胶原酶在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用，其特征是，具体步骤如下：

(1)将权利要求6纯化所得的重组胶原酶按照1:40的体积比与草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白混合，在37℃水浴条件下反应；

(2)在步骤(1)中所述的反应分别进行至0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min时，终止反应，对反应产物做SDS-PAGE电泳分析。